1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3767.3-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉米Bt叩门晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 3: Maize Bt-ll 2014-01-13发布2014-08-01实施手。弱213各司0.r盈8飞网路毗前而315cOl羽飞电i白C时乓白15言J涂G中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3767
2、.3-2014 自自问叫君创彦刷掉A圭魔莉阶责川凌啡时出苟吼叫州林石斗、土口、分坦国M州立胞和走如研共静时即况乱然视承U公勇检不哗限志PA构时川有李M机局技口同hM布疫科协发。险物刊挡的口时生旦打。件归检澳华捕事文并境阳险轩胞中J刷趴mMm规制吟出宁口肌剧时呆呆毛-LLLA川剧加酣回帧帆，口口品系i茅口口口口.，.，币2号;，、1、;如LLLLZ明川川LLh叫叫叫叫苦-rzmmt白中定口口晶晶241688品品47608I品品IC品11-口3的一人人君制相配川mmummmmmm川尘mmmMmmztzm川时川畔刺J口要方BBGMMMM米米米米米豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜T凹的训也广勒出用选米
3、米米米米米外玉玉玉玉玉大大大大大水水水水kk水水小甜油VG件家单咀起刊喃地而44玉玉玉玉王. 四照文国革手要.分分分分分分分分分分分分分分分分分分分分分盯分分分分分分分分分唱部部部部部部部部部部部部部部部部部部部吨为按本由起民主fLT立口部部部部部部部部012345678901234567890分分意分阶人阶大456789111111111122222222223部部注部立口七十立口唐创第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本刊?本仁KEr 局刘I SN/T 3767.3一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉米Bt-ll品系1
4、 范围SN/T 3767的本部分规定了e检测方法。本部分适用于玉米及其加本方法的定性检测低限为02 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室GB/T 19495.2 转基因产GB/T 19495.3 GB/T 19495.5 GB/T 19495.7 SN/T 3767.2-2014出筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理的环介导等温扩增(LAMP)初筛件，仅注日期的版本适
5、用于本文于本文件。LAMP) 检测方法第2部分:根据转基因玉米Bt-ll品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，SN/T 3767.3-2014 特异性目标序列和l引物碱基序列参见附录A。引向特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用B叫酶启动循环链置换反应，在玉米BH1品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应j容液中的Mg2结合，产生副产物(焦磷酸馍)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的D
6、NA荧光染料.可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为楼色;当发生扩增反应时伞，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光倍号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC士0.50C和80.0oC :1: 0.5 oC 0 6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mLo 6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll00
7、0L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs t容液:每种核昔酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有问等效果的DNA聚合酶):酶放度8U/，uL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化押、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镇溶液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mo
8、l/L 6.3.7 显色液:SYBRGre巳n1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米Bt11品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内寻|物1，内引物2，环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:192 bp 夕卡引物l(F3，5一3): GCTGT AGCTGGCCT AA TC 外引物2(B3，5-3):GGCCAAGGTATCTAATCAGC 内引物1(FIP , 5 -3 ) : T A TCTGTCTCAGGGGCAG ACTCTCAACTGGTCTCCTCTCC 内引物2(BIP，5人3): GCCAAGAAGGCGCAAGTCCATCC
9、CATTTGTGA TCTTTGTC 环引物1(FLP , 5 -3 ) : G TG TTCCCTCGG A TCTCG 环引物2(BLP，5-3) : ACCGCGAGTTGTTGTATCATA 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2 SN/T 3767.3-2014 6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); -一-LAMP反应的空白对照(
10、以DNA府解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测.结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米B11品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1玉米Bt-11品系LAMP反应体系主f:l分工作液浓度加样量/f1L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10
11、2.5 外侧上游号|物CF3)10 f1 mol/L 0.5 0.2 f1 mol/L 外侧F游引物CB3)10 /imol/L O. 5 0.2 /imol/L 内侧上游引物CFIP)40 mol/L 1. 0 1. 6 f1 mol/L 内侧下游引物CBIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 上游环引物CFLP)20mol/L 1. 0 0.8mol/L 下游环引物CBLP)20mol/L 1.0 0.8mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 口户1 mol/L 硫酸续150 mmol/L 1 6 mmol/L BSI DNA
12、聚合国每8 U/L 1 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 7)( 补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 oc士0.5oc恒温扩增90min , 80.0 oc土0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4 .5 显色反应反应结束后，将显色掖与反应液上下颠倒轻轻泪匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。3 SN/T 3767.3-2014 6.5.2 空白对照:反应管中液体呈憧色。6.5.3 阴性对照:反应管中液
13、体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因玉米Bt-11品系初筛阳一一按照GB/T19495.5 一一可对外引物PCR扩8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因玉米附录A): 况进行结果判断和表述。SN/T 3767.3-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米Bt-11品系基因序列A.1 转基因玉米Bt-11品系特异目标序列(来自Access
14、ionno.A Y 123624.1和AY629236) GCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGGAGGG ATTCTTGGA F3: B3: GGCCAAGGTATCTAATCAGC Flc fL C T fL T C 尸LT Z-c fht-T -G -G iT /C A A/ C T A.2 引物础基序列及构成pi TA hr TATCTGTCTCAGGGGCAGACTC BIP: Blc GCCAAGAAGGCGCAAGTC 132 CATCCCATTTGTGATCTTTGTC FLP: GTGTTCCCTCGGATCCG BLP: D 叮FONi的.hh的HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉米Bt-11品系SN/T 3767.3-2014 长中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三旦河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.x 印张0.75字数12千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1一1300 定价16.00元告令书号:155066 2-27430 SN/T 3767.3-2014
