1、华人民共和旺入境检验检疫行业标准SN/T 3767.5-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第5部分:玉米GA21晶系Loop田mediatedisothermal amplification detection method for genetical1 y modified components in food for export-Part 5: Maize GA21 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3767.5-2014 F.l1J 疫MAX能卅验彭-J检玉臼、兑古7阶如入切立目即出面nu川
2、UE剖3幸东扎为Jdj仁叫分旦国荆哄胞和政川EM共悍方的民1克测时人如瓦检不哗FR彦肌构片和常机局技勇M布疫科叮的申阳MobM拗队也卡汹曰的口企生时。件归的澳哑草文并境随时特阳山jub认忡们附则利会黠口凡东午J的专员福疫肩成系系-JLLL系古和眈MU以眼咽地加?呆呆呆协zzrL协咛叫叫rEhL节立自印刷问中盹品品品臼M们UMm阴阳哺咱凡件川rm川wumh品品LE口阳拍4+山叩门的卜内I人入碧叫如胁问:mmmmmmNmmMMmmmMmm阳山川mmmE川口23叫米米米米米豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜TW町的认立EM酬刷MMMMMMM玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小甜油WG件家制阳酣-A川
3、A川八如A川A川A川A川分分才才才止，、矿才分分才才分上S照文国草肝要7分分分分分分才，才止11111111为按本由起民主FFH部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部音r部部部部立口音立口音部分分意分分分nu-9nU4A户Ub阿/OOQUAU1inLquA吐Dnb勺tooodnUAAV123456789111111111122222222223部部注部部句部卧第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本制本局SN/T 3767.5-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第5部分:玉米GA21品系1 范围SN/T 3767的本部分规定(LAM
4、P)初筛检测方法。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 19495.2 GB/T 19495.3 GB/T 19495.5 GB/T 19495.7 转基因SN/T 2668 转基因植物SN/T 3767.2-2014出选方法3 防污染措施l品系特异性的环介导等温扩增件，仅注日期的版本适用于本文于本文件。LAMP)检测方法第2部分:筛环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。1 SN/T 3767.5-2014 6 LA
5、MP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理根据转基因玉米GA21品系外源基因序列设计特异性内、外号|物和l环引物各一对，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A，引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用stDNA聚合酶启动循环链置换反应，在玉米GA21品系特异目标序列启动互补链合戚，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应悔液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镇)，形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到
6、双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时码，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水陆锅或加热模板:63.0 C士0.5C和80.0C士0.5C。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.511L10L;量程10L100L;量程100L1 000 f1L。6.2.5 :十时器。6.3 试剂和材
7、料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs恪液:每种核廿酸浓度10mmol/L。6.3.3 st DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合国每):酶浓度8U/f1L。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化挥、20mmol/L硫酸镜、1%TritonX一100。6.3.5 硫酸镜溶液:100 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L , 6.3.7 显色液:SYBRGr巳en
8、1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米GA21品系外源基因序列设计一套特异性引物，包括外引物l、外引物2、内引物l、内引物2、环引物1和环引物2，2 外引物扩增片段长度:197 bp 夕卡引物1(F3，5-3): GCTGTAGTTGTTGGCTGT 夕i、寻|物2(B3 , 5 -3 ) : CCTTTT AACTGA TG TTTTCACTT 内寻|物l(FIP, 5-3): TGGGGGATCCACTAGTTCTAGAG-GTGGAAAGTTCCCAGTTGA 内引斗却2(BIP, 5 -3): GCAGGTCGAGGTCATTCATATG GACCAGGTAATCTTA
9、CCTTTG 环引物l(FLP，5一3): CTGCACTTCCTCTTT AGCA TCC SN/T 3767.5一2014环引物2(BLP，5-3): CTTGAGAAGAGAGTCGGGATAGTC 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照采用不含有目标基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA为模板，浓度应略高于方法检测低限。6.4.1.3 设两个空白对照一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基
10、因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-20H的规定进行。6.4.3 LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液?昆合进入反应液中。表1LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 1 外引物1CF3l10mol/L 0.5 0.2mol/L 外引物2CB3l10mo
11、l/L 0.5 0.2mol/L 环号|物lCFLPl40mol/L 0.5 0.8mol/L 环引物2CBLPl40mol/L 0.5 0.8mol/L 内寻|物1C FIPl 40mol/L 1.0 1.6mol/L 内引物2CBIPl 40mol/L 1. 0 1.6mol/L dNTPs 10 mmol/L 3.5 1. 4 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4.0 0.8 mmol/L 硫酸馁100 mmol/L 1.0 4.0 mmol/L Bsl DNA聚合酶8 U/L 1. 0 0.32 U/I-L DNA模板100 ng/flL 2.0 8.0 ng/L 水补足至25.03
12、 SN/T 3767.5-2014 6.4 .4 LAMP反应参数63.0 C士0.5C但温扩增60min ,80.0 C士0.5C 5min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做6.5.2 空白对照:反应管中液6.5.3 阴性对照:反应管中液6.5.4 7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应转基因玉米GAZl品系初筛阳8 结果表述
13、8.1 检测结果为阴性，表述8.2 检测结果为转基因玉米4 照结果正常，可判断该样品检测结实验对照结果正常，可判断该样品实验情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.5-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米GA21品系目标基因序列及LAMP引物A.1 转基因玉米GA21品系外源基因序列(来自AccessionNo.AJ878608.1) 1 GCTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAGGATGCTAAAGAGGAAGTGCAG 61 CTCTAGAACT AGTGGATCCC CCAGCTTGCA TGCCTGCAGG TCGAGGTCAT TCATAT
14、GCTT 阿一?吁伊寸俨仰伊W巧巧叮吨巧121 181 AAACATCAGTT AAAAGG PA TA FA A.2 LAMP引物碱基序列及构成F3: GCTGTAGTTGTTGGCTGT B3: FLP , BLP , BIP: 卢d 寸-ON|.hh的H在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第5部分:玉米GA21品系SN/T 3767.5一2014只中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张0.75字数12千字2014年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元只书号:155066.2-27432 SN/T 3767.5-2014
