1、中华人民共和出入境检验检疫行业标准SN/T 3767.6-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第6部分:玉米MIR162晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 6! Maize MIR 162 2014-01-13发布2014-08-01实施指飞机。码:x.3;_Vo_ N二om 林1密飞3 巳 m 饲挝、1雨雨i5也诏4活932315中华人民共和国发布国家质量监督检验栓痊
2、总局SN/T 3767.6一-2014目U州南全叫七J士豆气、-J、人棠时出Jo东星U户JRH叫协配脚AeJ和共t、力剧院辑方人J测华玲检中伟P 局阶柳川疫鹤也检嘉增民验正扩日检勇辄阜hm境志旦出入李导盹提出七介肌刽门明可耐员厦持分.，.，.，.，.，.，。出委国+呐喊，.，暗暗毛系Ld晾系吩给理和津?呆呆呆际协嘟嘟肌机呆呆眠叫叫叫:脱呆呆协Tr?际问川时时时中定口羽品品24168的品品-47608I品品口C品11-品3的一人阳和1川6lMmummM创侧目mmmmmm创刊mmm剧2kp411与7IR华陈食求法时盯MmmROOMM下29AADGMBKKKU阳hum阳盯mu肌冲人口要方BBGMMM
3、M米米米扪扪豆豆豆豆一旦稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜TW叫认位草出用选米米米米米米米玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小甜油WG家单起叫喃地摊34玉玉玉玉3四照国草要.分分分分分分分才，才才才才才分分分分分分分分7分分分分分分LJ才LJRVFi为按由起主门部部部部部部部部部部部音立口部部部部部部部部部部呻部部部部部部分分分分分nu-nLquA吐FDnb7OOQdnu-Lndd二zunb7OOQunuV12345678911111111112222去222223部部部部部md第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本本本。本贝局秋疫许SN/T 3767.6一-2014出口食品中
4、转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第6部分:玉米MIR162品系1 范围SN/T 3767的本部分规定了转达四玉米MIR162品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于玉米中转基因玉米MIRIJi2品系特异性的定性检视与本方法的定性检测低限为0.5%(质量分数)0 2 规苟性引用文件/ y 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的轩那文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(佳括所有的修改立在)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水理楼相辑方法JGB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求(飞毛GB/T
5、19495.3 转基因产品检测/核酸提取纯化方法/l GB/T 19495.7 转基因产品检削船样和制样方法SN/T 3767.2一2014出口食J品中转基因成分环介导等混扩增CLAMP)检测方法第2部分=筛选方法3 缩略语/f t 下列缩略语适用于本文件3.1 adh 1:玉米乙醇脱氢酶IUlcottoidehydrogenpU)基间。4 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。J 5 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。6 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。SN/T 3767.6-2014 7 LAMP检测方法7.1 原理
6、7. 1. 1 一般原理根据转基因玉米MIR162品系外源、基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在玉米MIR162品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA泪合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应洛液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。7. 1. 2 显色液显色原理SYBR Gr巳巳n1是一种高灵敏
7、的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。7.2 仪器和设备7.2.1 超纯水发生器。7.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oc士0.50C和80.0oC士0.5oC。7.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。7.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L 7.2.
8、5 计时器。7.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。7.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。7.3.2 dNTPs榕液:每种核昔酸浓度10mmol/L。7.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶放度8U/ f1L。7.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸债、100 mmol/L氯化饵、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100 。7.3.5 硫酸镜溶液:100 mmol/L。7.3.6 甜菜碱:5mol/L 7.3
9、.7 显色液:SYBRGre巳n1荧光染料，1000。7.3.8 引物:根据转基因玉米MIR162品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2。2 外引物扩增片段长度:214bp夕卡引物1(F3,5-3): TGATTAGAGTCCCGCAATT 外引物2(B3, 5 -3): TCATACAAAAAGGCCCAGT 内引物1(FIP , 5 -3 ) : AACA T AG A TG ACACCGCGCGGCGATAGAAAACAAAATATAGCG 内引物2(BIP , 5 -3) : A TTCAGT ACA TT AAAAACG TCCGCC
10、-AAAACAACT ACCACAAGGC SN/T 3767.6-2014 7.4 实验步骤7.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置7.4. 1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。7.4. 1.2 阳性又才照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。7.4 .1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品): LAMP反应的空白对照(以DNA梅解液代替DNA模板)。7.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重
11、新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。7.4.3 玉米MIR162品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表l。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA悔j夜完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将11.lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液?昆合进入反应液中。表1玉米MIR162品系LAMP反应体系主旦分工作液浓度力日样最/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 1 外引物1(F3)10mol/L 0.5 0.2 f1mo l/L 外引物2(出)10mol/L 0.5 0.2 vmol/L 内引物l
12、CFIP)40 vmol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续100 mmol/L 1. 5 6 mmol/L BsL DNA聚合酶8 U/L 0.32 UIvL DNA模板100 ng/L 2 8日g/f.lL水补足至25.07.4.4 LAMP反应参数63.0 C士0.5C恒温扩增90min , 80.0 oC土0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。7.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立
13、即在黑色背景下进行颜色观察。3 SN/T 3767.6-2014 7.5 质量控制7.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。7.5.2 空白对照:反应管中液体呈撵色。7.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。7.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。8 结果判断和确证8.1 待检样品2个平行样反应管中蔽体均虽撵色，陀时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。8.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈f绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因玉米MIR162品系初筛阳性，还应通过王歹豆
14、方法之一进衍确证(见附录A): /俨一一按照欧盟的方法(CRLVL08/08P)进行实时荧主IT/PCR检测;/严可对外引物PCR扩增产物进行序列测定/一一其他验证方法。饥。叫叫一叮叮十一如一一9 结果表述9.1 检测结果为阴性，表述为叮亥样品未检血转基因正米MIRf6Q、品系。/产:9.2 检测结果为转基因玉米MIRlEi2品系初筛阳/1茧，应按黑确证实验情况进行结果判断和表述。zptpspape品f J / 5互EFjfjs/257 jt p j j 4 SN/T 3767.6-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MIR162品系基因序列A.1 转基因玉米MIR162品系特异性基因序列
15、(accessionno. HI203349) (外引物扩增长度:214bp)TGAT TAGAGTCCCG CAATTATACA TTTAATACGC GATAGAAAAC 八AAATAT AGC GCGCAAACT A GGA T AAATT A TCGCGCGCGG TGTCATCT A T GTTACTAGAT CCCCGGGTCT AGACAATTCA GTACATTAAA AACGTCCGCC ATGGTCTGAA GGCAACAGAT AAGGCATACT GGGCCTTGTG GTAGTTGTTT T ACTGGGCCT TTTTGT ATGA A.2 引物序列及构成F3: T
16、GA TT AGAGTCCCGCAATT B3. TCA T ACAAAAAGGCCCAGT Flc F2 嘎FIP. AACATAGATGACACCGCGCG叩GCGATAGAAAACAAAATATAGCGBlc B2 BIP: ATTCAGT ACATT AAAAACGTCCGCC-AAAACAACT ACCACAAGGC 5 2日|.hh肉同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第6部分:玉米MIR162品系SN/T 3767.6-2014 争G中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址.c丑中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本880X12301/16 印张0.75字数12千字2014年11月第一版2014年11月第一次印刷印数1-1300 定价16.00元除书号:155066 .乙27433SN/T 3767.6-2014
