1、华共和境号金行标准SN/3767.8-2014 出庭主白白转成分环介导)检测方法等温扩增(LAM第8部分:MON810晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 8: Maize MON81 0 2014-0卜13发布2014-08田01实施中华人民共和圈发布自家庭竞量监督栓验捡瓷总局SN/T 3767.8 2014 目。山湖验J检峰任境阵古川人-TLUU啤出幸生利-h曾呻蛇口乱341二国淑为仪和LTUM
2、HU共J出民L楠即陆人情松协和哗肥且拥构EU有勇呛机局技志P布疫科李M发。互助、川的口酣生惮郎。件归检澳妇门草文并境恤望酣胞中J制队忖悚抖规利会削且mA.，的专口F珠度珊协眼毛呆呆品暗品毗拙拟眼阳她哺二，!协眠瞅瞅肌肌1，毛品咱咱叫川弈，乱叫眼品际古和万中盯阳明醉其也L因义系茅茅I口0389茅系口口四凸MJ9口口茅系口um茅9E口1口口品第2容监民境he基定品品品但MmMm阴阳明明LMUmMM3口口口阳hUFL品411户中口mv明内I人入扣一旦旦阳山mmm川川川江旦出口口口口zrttt肌食用选米米米米米米米玉玉玉玉玉大大大大大kkkkkkkk卜甜油VG件家朝阳起刊通筛玉玉433玉王. UUUU
3、-U-V四照文国草手要om分分分分分分分才尤分分分分分分分分分分分分分分分分分分分分分为按本由起士/、王磊E部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部民彦T部部部部部部部立口部012345678901234567890分分意分分人分常123456789111111111122222222223部部注部部呈部。山第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本uqll本登J李局刘I SN/T 3767.8-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第8部分:玉米MON810晶系1 范围SN/T 3767的本部分规定了扩增CLAMP)初筛检测方法。本部分
4、适用于玉米及其加工本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，其GB/T 6682 分析实验室用SN/T 2268 转基因植物品SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 I功污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理N810品系特异性的环介导等温件，仅注日期的版本适用于本文本文件。)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对并
5、添SN/T 3767.8-2014 加一对环引物，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸兰磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNAy昆合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6. 1.2 显色
6、液显色原理SYBR Gre巳n1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC:!:0.5 oC和80.0oC士0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程1
7、0L100L;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/p.L。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl ( pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氯化抑、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:150 mmol/
8、L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，环引物1和环引物2。2 外号l物扩增片段长度:192 bp 外引物扩增片段长度:228 bp 夕卡引物l(F3，5人3):GGGCTACATCGAAGACAGC 夕卡引物2(B3，5-3): GCAAGCAAATTCGGAAATGA 内引物l(FIP, 5 -3 ,): GCCAGAGGGAACCAGTACCGATTTACCTGATCCGCTACAA 内引物2(
9、BIP , 5 -3) : AAGTGTGCCCACCACAGCGAAAGTCCTCGTTCAGGTC 环引物l(FLP，5一3): TTGACGGTCTCGTGCTTG 环引物2(BLP , 5 -3) : CACCACTTCTCCTTGG ACA T SN/T 3767.8-2014 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取
10、空白对照(以水代替样品); 一一一LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内掘基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米MON810品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA榕液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液?昆合进入反应液中。表1玉米MON810品系LAMP反应体系组分工作液
11、浓度加样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2. 5 l 外引物1(F3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 外引物2(B3)10mol/L 0.5 0.2 I1 mol/L 内引物1(FIP) 40mol/L 1. 0 1. 6 11mol/L 内引物2CBIP) 40 l1 mol/L 1. 0 1. 6 11mol/L 环寻|物lCFLP)20mol/L 1. 0 0.8mol/L 环寻|物2(BLP)20mol/L 1. 0 0.8 I1 mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续1
12、50 mmol/L 1 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L l 0.32 U/L DNA模板100 吨/L2 8 ng/L 7.( 补足至25.06.4 .4 LAMP反应参数63.0 oC :!:0.5 oC恒温扩增90min, 80.0 oC :!:0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。3 SN/T 3767.8-2014 6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2
13、 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液7 结果判断和确证转基因玉米MON810品系初筛一一按照SN/T2668进行一一可对外引物PCR扩增8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因玉米4 对照结果正常，可判断该样品检测结(见附录A): 情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.8-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MON810品系基因系列A.1 转基因玉米MON810品系特异目标序列(来自Accessionno.AF490398.1) 433GGCTACAT CGAAGACAGC CAAGACC
14、TCG AGATTTACCT GATCCGCTAC AACGCCAAGC 49 1 ACGAGACCGT 611 ACCTGAACGA A.2 51物碱基序列及构成F3: GGCT ACA TCGAAGA B3 : GCAAGCAAA TTCGG A Flc FIP: GCCAG AGGG AACCA BLP:CACCACTTCTCCTT A 5 立ONi.huh的H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第8部分:玉米MON810品系SN/T 3767.8-2014 毛毛中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区兰里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷;-印张0.75字数12千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元兴书号:155066.2-27435 SN/T 3767.8一2014
