1、华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3767.9-2014 出食晶中转基成分环介导等温扩增(LAMP)检测法第9部分:MON863品系Loop-mediaed isohermal amplification deedion mehod for genetically modified componens in food for expor-Par 9 Maize岛10N8632014-01-13发布2014-08-01实施中华人段共和国发布由家横量监督检验拴疫总局SN/T 3767.9-2014 目。疫检验诚检以任境曹附责人哥叫川出li们可忖林李工i=i八刀此一一耳青共这剌宋法用共超方
2、UU民乱鸿测眈人忧湛准科哗肌在mu构J有口口川川机茄技目中L，咛牛皮科叫小，即发。检物二、口哨旧验在减日阻。何-Ff检的重草文并境阳军怦垣本出入外七十HU是:l广，4时拟批刽削口肌胎分的专口Y上度时叮叮叮呆呆呆品朵朵毗川川师股咽地旧f呆呆瞅瞅川灿毛品哺品川崎!咱zwf引系万LU门9能管如槛甜瓜211叫mmmmZ叫山川rz古旧mM叫4rz市江帆zbm山mmmmmmNmmm阳muzzmmNmZ肝川121叫t米米米米米豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜TWq认主f茸出用选米米米汗长长、/:国骂阿通筛玉玉玉玉玉玉到1.玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水心甜油NG件家单和起6 . 分分分分分分分女女才分分
3、分分分才才才LJAJAS照文国革知要盯分分分分分分分分分部部部部部部部甜甜部部部部部部部配部部部部为按本由起J主T部部部部部部部部部分分意分分阳识分nu419qu4AFbpb勺tOOQUAU1止叮Lqu4&严bpbiOOQnulfUW123456789111111111122222222223部部注部部勾部引第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本刊小本局SN/T 3767.9-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第9部分:玉米MON863品系1 范围SN/T 3767的本部分规定了初筛检测方法。本部分适用于玉米及其制品本方法的定性检测
4、低限为O.2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 防污染擂施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理性的环介导等温扩增CLAMP)件，仅注日期的版本适用于本文本文件。LAMP)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米MON863品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异SN/T 3767.9-201
5、4 性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，手iJJI st酶启动循环链置换反应.在玉米MON863品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA泪合物，加入血色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYR Geen L是一种高灵敏的DNA荧光染料.可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与y，Y.链DA结合时.灭Yt信号是游离状态的8001 000 倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变.颜色眼J见为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DN人的增加，SY13R染和|的
6、荧光信号也随之大幅度增强.其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 届纯水发生器。6.2.2 水浴fr);IIJi: n热模板:63.0C土0.5C和80.0C土0.5C , 6.2.3 7主i心管:0.1mL ,1. 5 mL , 6.2.4 移液器C过程。.0!lLlO !lL;量程10!lLlOOL;量程100 !J.L 1 000L 6.2.5 rl日才#ff0 6.3 试剂和材料|垛另有规阜外.所有试开iJ均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验111水:山符合G/T6682中级水的规格。6.3.2 dNTPs 容被:每种核拧酸浓度10
7、mmol/L。6.3.3 st DNA聚合酶(如:NEB公司或具有|司等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/!J.L。6.3.4 10 ThcrmolPol缓冲液:含200mmol/L Tris日Cl(pH值为8.8 )、100mmol/L硫酸债、100 mmol/L氧化怦、20mmoI/L硫酸镜、1%丁ritonX-100。6.3.5 硫酸读溶液:150 mmol/Lo 6.3.6 甜菜碱:5mol/L 6.3.7 显色液:SY13R Grecn 1荧光染料，1000。6.3.8 寻|物:根据转基闲玉米MON863外源基|址和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物l和内
8、引物2，环引物。外引物扩增片段长度:195 Lp 夕卡引物1(F3 , 5 -3) : CCTTTTGA TGAAGTGACAGG 剑、寻|物2(133，5一3): AAGTCCAGGTTGGTTGGT 内寻|物1(FIP ,5 -3 ) : ACTA TTG ACCCT ACTTG TTCGG A -T AGGA TCGG AAAGCTTGGT A 内引物2(BIP , 5 -3 ) : TAGGCCGTAACATTTAGCAAAAAAC AGTGATAGGAGACTATCTAGCT 上游环引物(FLP，53): TGGGTGTTCACCCCAAAGTG 6.4 检测步骤6.4.1 阴性对照
9、、阳性对照和空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性又才照:采用不含有待i则基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 151性对照:采用含有待iYliJ基!为Iff:列的植物DNA作为模板或含有日的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。? SN/T 3767.9-2014 6.4.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNAi容1(11日夜代替DNA攘板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测1Js应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;百则应重新进行DNA提取和纯化。内源基囚的检测参照SN
10、/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米MON863LAMP反应体系LAMP反应体系见表l。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全力11入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1玉米MON863LAlVIP反应体系主且分l丁作液浓度加样量/，uL反应体系终浓度丁hcrmoPol缓冲液10 2.5 外引物l(F3l10mol/L 0.5 0.2mol汀，外号|物2C巳3)10mol/L 0.5 0.2 11mol/L 一一一一一一一一内引物1FIPCF1c+F2l 40mol/L 1.
11、 0 1. 6 Vmol/L 内引物2BIPCBlc+B2)40 vmol/L 1. 0 1. 6 vmol/L 上游环引物(FLP句S-3) 40mol/L 0.5 0.8 11mol/L dYfPs 10 mmol/L 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mol/L 硫酸筷150 mmol/L l 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L l 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/vL 水补足至25.06.4.4 LAlVIP反应参数63.0 C士0.5C恒温扩增90mi丑，80.0C士0.5C 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5
12、显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。3 SN/T 3767.9一20147 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样
13、品转基因玉米MON863初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 按照SN/T2668-2010进行实时荧光PCR检测;一一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。8 结果表述系8.1 检测结果为阴性，表述为4 SN/T 3767.9-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MON863基因序列A.1 转基因玉米MON863的PCR产物序列CAccessionnO.GX181953.1) A.2 引物碱基序列及构成F3: CCTTTTGATGAAGTGACAGG B3 , AAGTCCAGGTTGGTTGGT PA YEEA RU 5 2日|.hh的同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第9部分:玉米MON863品系SN/T 3767.9-2014 各【中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?夺印张0.75字数14千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元令书号:155066 2-27436 SN/T 3767.9-2014
