1、ICS 6712099B 45 睿雪中华人民共和国国家标准GBT 211662007肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of nitrofuran metabolites residues in casingLC-MSMS method2007-10-31发布 2008-04-0 1实施宰瞀鹃紫瓣訾雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19刖 吾GBT 211662007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈惠兰、丁涛、沈崇钰、吴斌
2、、徐锦忠、林宏、李公海、张扬、蒋原、蔡宝亮、陶宏锦。肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2116620071范围本标准规定了肠衣中呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉一3一氮基一2一嚼唑烷基酮(简称AMOZ)、呋喃西林的代谢物氨基脲(简称SEM)、呋喃妥因的代谢物1一氨基一2一内酰脲(简称AHD)和呋喃唑酮的代谢物3一氨基一2一唔唑烷基酮(简称AOZ)残留量的液相色谱一串联质谱的测定方法。本标准适用于肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适
3、用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-1992，neq ISO 3696：1987)3方法提要硝基呋喃类药物在动物体内迅速分解，其原位稳定性只有数小时，而其代谢物在动物体内容易和蛋白组织结合，十分稳定。在酸性条件下，与蛋白质组织键合的硝基呋喃类药物代谢物游离出来，与衍生化试剂避光衍生化16 h，乙酸乙酯提取后，浓缩定容，用液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料41水：应符合GBT 6682规定的一级水。42甲醇：HPLC级。43乙
4、酸乙酯：HPLC级。44乙酸铵：HPLC级。45无水磷酸氢二钾：分析纯。46二甲基亚砜：分析纯。47邻硝基苯甲醛：分析纯。48盐酸：3638分析纯。49同位素内标：AHD_13C3，AMOZ-D5，AOZD4，SEMHCl一(”C，“N2)，100 vgmL，纯度98。410 AOZ、SEMHCl、AMOZ和AHDHCI标准品：纯度98。411 AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准储备溶液：1 mgmL。准确称取适量的AOZ、SEMHCl、AMOZ和AHDHCl标准品(410)，用甲醇(42)配成10 mgmL的标准储备液。储备液贮存在4冰箱中，1年有效。412 AOZ、SEM、AMOZ和AH
5、D标准工作溶液：用甲醇分别配成浓度为100 ngmL、10 ngmL标准工作溶液，标准工作溶液在4保存，3个月有效。413内标溶液：用甲醇配制浓度为50 ngmL四种内标混合溶液，内标混合溶液在4C保存，1年有效。414衍生化溶液：50 mmolL邻硝基苯甲醛。称取0037 8 g的邻硝基苯甲醛(47)到50 mL烧杯1aBT 21 1662007中，加入5 mL二甲基亚砜(46)溶解，现配。415磷酸氢二钾缓冲液(1 molL)：称取871 g无水磷酸氢二钾(45)，加入500 mL水溶解。5仪器51液相色谱一串联质谱仪(串联四极杆)；配有电喷雾离子源。52分析天平：感量001 g和01 m
6、g各一台。53旋转蒸发仪或相当者。54水浴振荡器。55旋涡混匀器。56贮液器：50 mL。57真空泵：真空度应达到80 kPa。58离心机。59移液器：5 mL，200“L。510离心管：sO mL，具塞。6试样的制备与保存61试样制备将实验室样品绞碎均匀，分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品袋中，密封，并做上标记。62试样保存将试样于冷冻状态下保存(一18C)。7测定步骤71提取准确称取200 g试样，置于50 mL具塞离心管中，准确加入0100 mL 50 ngmL四种内标混合溶液(413)、4 mL水、05 mL 1 molL HCl、150“L邻硝基苯甲醛溶液(414)，于旋涡
7、混匀器上快速混合30 s，37水浴振荡过夜(16 h)。取出样品，冷却到室温后，加入35 mL磷酸氢二钾缓冲溶液(415)，调节样品溶液pH 775。加入8 mL乙酸乙酯，混合30 s，2 500 rrain离心5 min，取上层乙酸乙酯溶液到50 mL玻璃试管中，再加入8 mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40水浴旋转蒸发干。用甲醇水溶液(4+6)10 mL定容，过045”m的滤膜到进样瓶中，供液相色谱一串联质谱仪测定。72标准溶液的衍生化分别准确移取100 ngmL和10 ngmL四种标准混合溶液(412)020 mL、010 mL和0050 mL到相应干净的50 mL玻璃离心管
8、中，准确加入0100 mL四种标准内标混合溶液(413)、05 mL 1 molLHCl、150“L邻硝基苯甲醛溶液(414)，于旋涡混匀器上快速混合30 s，37水浴振荡过夜(16 h)。按照样品提取步骤处理(71)后，供液相色谱一串联质谱仪测定。73测定731参考液相色谱条件a)色谱柱：C18，5“ITI，150 mm21 mill(内径)，或相当者；b) 流动相：甲醇(A)+05 mmolL乙酸铵水溶液(B)；c)流速：025 mLmin；d)梯度洗脱程序；o mln-60 rain 2060A，6 rain8 rain 60A，8 rain9 rain 6080A，9 min91 ra
9、in 8020A，91 mintl05 min 20A；e)柱温：室温；f)进样量：25“L。2732a)b)c)小e)串联质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源(ESI)，正离子监测；扫描方式：选择离子检测(SRM)；雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度；选择离子对见表1。表1选择离子对GBT 2”662007母离子 子离子测定物质(mz) (mz)13404AOZ 23601040AOz-D4 2400 134031660。SEM 20901920SEM一(”C，“N2) 2120 168O134AHD 2490178AHD-”C3 2520
10、134291AMOZ 3350262AMOZ D5 3400 29605a定量离子。733液相色谱一串联质谱测定衍生化后的标准工作溶液(72)在液相色谱一串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度(ngmL)为横坐标，绘制6点标准工作曲线(o5 ngmL20 ngmL)，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，其相应的标准物质、内标色谱图和串联质谱图参见图A1和图A2。74空白试验除不加入试样外，按上述步骤进行。8结果计算结果用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中硝基呋喃代谢物的浓度，结果需扣除空白值：一
11、等等 。z一百i L 1式中：cx样品中硝基呋喃代谢物的浓度，单位为微克每千克(-gkg)；A。样品中硝基呋哺代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值；m。硝基呋喃代谢物标准的质量，单位为纳克(ng)；A。标准品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值；m样品质量，单位为克(g)。GBT 21 16620079测定低限和回收率范围本方法中四种硝基呋喃类代谢物测定低限均为05 pgkg。肠衣中四种硝基呋喃类代谢物添加浓度及回收率范围(内标校iE)的试验数据(n一10)05。ugkg添加水平，回收率范围在92104；10 pgkg添加水平，回收率范围在87120；20 pgkg添加水平，回收率范围在91112。附录A(资料性附录)标准品色谱图及二级质谱碎片图GBT 2”662007train图A1 硝基呋喃类代谢物和其相应内标离子流色谱图5ooooooooGBT 211662007103，970 10397513390133900 133905 104 060 104065 133995 134ooolwz mz ndz16蛊995 l韩000 1919蛄 192000mz mzAMOZ图A2 四种硝基呋喃代谢物二级质谱碎片图帅弓加。
