1、ICS 6718010B 47 香雷中华人民共和国国家标准GBT 211672007蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of nitrofuran metabolites residues in royal jellyLC-MSMS method2007-10-31发布 2008040 1实施中华厶县共和国国塞质量监督检验检疫总局岩右中国国家标准化管理委员会及111刖 昌GBT 21 1672007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起
2、草人：丁涛、徐锦忠、沈崇钰、吴斌、陈惠兰、赵增运、张扬、朱春、蒋原、陶宏锦。蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2116720071范围本标准规定了蜂王浆中呋喃它酮的代谢物5一甲基吗啉一3一氨基一2一嚼唑烷基酮(fg称AMOZ)、呋喃西林的代谢物氨基脲(简称SEM)、呋喃妥因的代谢物1一氨基一2一内酰脲(简称AHD)和呋喃唑酮的代谢物3一氨基一2一嚼唑烷基酮(简称A0z)残留量的液相色谱一串联质谱的测定。本标准适用于蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包
3、括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq ISO 3696：1987)3方法提要硝基呋喃类药物在动物体内迅速分解，其原位稳定性只有数小时，而其代谢物在动物体内容易和蛋白组织结合，十分稳定。利用三氯乙酸溶液沉淀王浆中蛋白质后，邻硝基苯甲醛作为衍生化试剂避光衍生化16 h，乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料41水：应符合GBT 6682规定的一级水。42甲醇：HPLC
4、级。43乙酸乙酯：HPLC级。44乙酸铵：HPLC级。45三氯乙酸：分析纯。46无水磷酸氢二钾：分析纯。47二甲基亚砜：分析纯。48邻硝基苯甲醛：分析纯。49 同位素内标：AHD 13 C3，AMOZ-D5，AOZD4，SEMHCl一(”C，“N2)，100“gmL，纯度98。410 AOZ、SEMHCI、AMOz和AHDHCl标准品：纯度98。411 AOZ、SEM、AMOz和AHD标准储备溶液：1 mgmL。准确称取适量的AOZ、SEMHCI、AMOZ和AHDHCI标准品(410)，用甲醇(42)配成10 mgmL的标准储备液。储备液贮存在4冰箱中，1年有效。412 AOZ、SEM、AMO
5、Z和AHD标准工作溶液：用流动相分别配成浓度为100 ngmL、10 ngmL标准工作溶液，标准工作溶液在4保存，3个月有效。413内标溶液：用流动相配制浓度为50 ngmL四种内标混合溶液，内标混合溶液在4C保存，1年有效。1GBT 21167-2007414衍生化溶滚：50mmolL邻硝基苯甲醛。称取0037 8 g的邻硝基苯甲醛(48)到50mL烧杯中，加入5 mL二甲基亚砜(47)溶解，现配。415磷酸氢二钾缓冲液(1 toolL)：称取871 g无水磷酸氢二钾(46)，加入500 mL水溶解。416三氯乙酸溶液E2s(质量浓度)：称取25 g三氯乙酸溶解于100 mL水中。5仪器51
6、液相色谱一串联质谱仪(串联四极杆)：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量001 g和01 mg各一台。53旋转蒸发仪或相当者。54水浴振荡器。55旋涡混匀器。56真空泵：真空度应达到80 kPa。57离心机。58移液器；5 mL，200 HL。59离心管：50 mL，具塞。6试样的制备与保存61试样制备将实验室样品搅拌均匀，分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样保存将试样于冷冻状态下保存(一18)。7测定步骤71提取准确称取200 g试样，置于50 mL具塞离心管中，准确加入0100 mL四种标准内标混合溶液(413)、2 mL 25三氯乙酸溶液、3 mL
7、水，于液体混匀器上快速混合1 rain，室温下振荡60 min。2 500 rmin离心5 min，转移上层清液于干净50 mL玻璃离心管中，加入150 pL邻硝基苯甲醛溶液，37水浴振荡过夜(16 h)。取出样品，冷却到室温后，加入4 mL磷酸氢二钾缓冲溶液(415)，调节样品溶液pH 775。加入10 mL乙酸乙酯，混合30 S，2 500 rrain离心5 min，取上层乙酸乙酯溶液到50 mL玻璃试管中，再加入8 mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40C水浴旋转蒸发干。用甲醇水溶液(4+6)10 mL定容，过045“m的滤膜到进样瓶中，供液相色谱一串联质谱仪测定。72标准溶液
8、的衍生化分别准确移取100 ngmL和10 ngmL四种标准混合溶液(412)020 mL、010 mL和0050 mL到干净的50 mL玻璃离心管中，准确加入0100 mL四种标准内标混合溶液(413)、05 mL l molLHCl、150“L邻硝基苯甲醛溶液(414)，于旋涡混匀器上快速混合30 s，37水浴振荡过夜(16 h)。按照样品提取步骤处理(71)后，供液相色谱一串联质谱仪测定。73测定731液相色谱条件a)色谱柱：ClB，5“m，150 mmX 21 mm(内径)，或相当者；b)流动相：甲酵(A)+O5 mmolL乙酸铵水溶液(B)；c)流速：025 mLmin；d)梯度洗脱
9、程序：0 rain 60 rain 2060A，6 min8 rain 60A，8 rain 9 rain 6080A，9 min91 rain 8020A，91 min105 rain 20A；2e)f)732a)b)c)d)e)柱温：室温；进样量：25“L。串联质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源(ESI)，正离子监测；扫描方式：选择离子检测(sRM)；雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度选择离子对见表1。表1选择离子对GBT 21167-2007母离子 子离子测定物质(mz) (mz)13405AOZ 23601040AOZD4 2400
10、134o16604SEM 20901920SEM一(”C，13N2) 2120 1680。13 4aAHD 249O178AHD”C3 2j2O 134429l。AMOZ 335O262AMOZD5 3400 296048定量离子。733液相色谱一串联质谱测定衍生化后的标准工作溶液(72)在液相色谱一串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度(ngmL)为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，其相应的标准物质、内标色谱图和串联质谱图参见图A1和图A2。74空白试验除不加入试
11、样外，按上述步骤进行。8结果计算结果用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中硝基呋喃代谢物的浓度，结果需扣除空白值：“一每二坠 ”(1)sm式中：样品中硝基呋喃代谢物的浓度，单位为微克每千克(Lgkg)；A，样品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值；m，硝基呋哺代谢物标准的质量，单位为纳克(ng)；A，标准品中硝基呋哺代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值；m样品质量，单位为克(g)。GBT 2”6720079测定低限和回收率范围本方法中四种硝基呋喃类代谢物测定低限均为05 pgkg。蜂王浆中四种硝基呋喃类代谢物添加浓度及回收率范围(内标校正)的试验数据(n一10)05 pgkg添加水平，回收率在92116；10 pgkg添加水平，回收率在87112；20,ugkg添加水平，回收率在92肛109。附录A(资料性附录)标准品色谱图及二级质谱碎片图GBT 21 16720072 4 6 8 10timin图A1 硝基呋喃类代谢物和其相应内标离子流色谱图Oooo呻0oooGBT 21 1672007133 90 AOZl 1133 900 133 905 104060 104 065 133995 134 000r“z m，z ruz19200192000AM。z 一262。J图A2 四种硝基呋喃代谢物二级质谱碎片图
