1、lCS 67120X 04 囝雪中华人民共和国国家标准GBT 213122007动物源性食品中1 4种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱一质谱质谱法Analysis of fourteen quinolones in food of animal origin byhigh performance liquid chromatography tandem massspectrometry2007-1 0-29发布 2008-04-0 1实施宰瞀鳃鬻瓣警襻瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19刖 置GBT 213122007本标准的附录A、附录B、附录c、附录D、附录E均为资料性附录。本标准由中国
2、国家标准化管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：杨奕、国伟、吴永宁、彭涛、邵兵、李晓娟、代汉慧。本标准首次发布。1范围动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱质谱法GBT 213122007本标准规定了动物源性食品中14种喹诺酮药物残留量检测的制样方法和高效液相色谱一质谱质谱检测方法。本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋等动物源性食品中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、吡哌酸、萘啶酸、奥索利酸、氟甲喹、西诺沙星、单诺沙星14
3、种喹诺酮类兽药残留量的液相色谱一质谱质谱法测定和确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 66821 992，neq ISO 3696：1987)3方法提要用01moiL EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH4o)提取样品中的喹诺酮类抗生素，经过滤和离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化。高效液相色谱一质谱质
4、谱测定，用阴性样品基质加标外标法定量。4制样方法制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。41 动物肌肉和动物内脏将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在一IO。C以下保存，一周内进行处理。取适量新鲜或冷冻解冻的动物组织样品去筋、捣碎均匀。42牛奶将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在新鲜或冷冻解冻的样品混合均匀。43鸡蛋将现场采集的样品放人小型冷冻箱中运输到实验室，在新鲜的样品，去壳后混合均匀。5试剂和材料10以下保存，一周内进行处理。取适量10以下保存，一周内进行处理。取适量除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为GBT 6682规定的一级水。51柠檬酸：分
5、析纯。52磷酸氢二钠：分析纯。53甲醇。54乙腈。55甲醇一乙腈溶液：40+60(体积比)。GBT 21312200756甲酸(99)。5，7氢氧化钠：分析纯。58乙二胺四乙酸二钠：分析纯。59磷酸氢二钠溶液：02 molL。称取7l_63 g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1 000 mL。510柠檬酸溶液：01 molL。称取2101 g柠檬酸，用水溶解，定容至1 000 mL。511 Mcllvaine缓冲溶液：将1 000 mL 01 molL柠檬酸溶液(510)与625 mL 02 molL磷酸氢二钠溶液(59)混合，必要时用盐酸或氢氧化钠调节pH至400，05。512 EDTAMcll
6、vaine缓冲溶液：01 molL。称取605 g乙二胺四乙酸二钠(58)放入1 625 mLMdlvaine缓冲溶液(511)中，振摇使其溶解。513甲醇水溶液：5(体积分数)。514甲酸水溶液：02(体积分数)。515喹诺酮类药物标准物质：恩诺沙星(enrofloxacin，CAS：93106-606)、诺氟沙星(norfloxacin，CAS：70458967)、培氟沙星(pefloxacin，CAS：6159-553)、环丙沙星(ciprofloxaein，CAS：8572l一33一1)、氧氟沙星(oflaxacin，CAS：82419-361)、沙拉沙星(sarafloxacin，C
7、AS：98105998)、依诺沙星(enoxacin，CAS：74011-588)、洛美沙星(10mefloxadn，CAS：98079517)、吡哌酸(pipemdilic acid，CAS：51940444)、萘啶酸(nalidixic acid，CAS：389082)、奥索利酸(oxolinic acid，CAS：14698294)、氟甲喹(flumequine，cAS：42835256)、西诺沙星(cinoxacin，CAs：28657-809)、单诺沙星(danofloxacin，CAS：7401卜588)(纯度99)。516标准溶液5161标准储备液：分别称取0010 0 g标准品
8、(51 5)置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准储备液浓度为1 mgmL，一20冰箱中保存，有效期3个月。5162标准工作液：将以上各标准储备液(5161)稀释，配成混合标准溶液。各组分浓度为10 pgmL。此标准工作液于4保存，可保存3个月。517 HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)或其他等效柱。6仪器61 高效液相色谱一串联质谱仪。62电子天平：感量0000 1 g。63电子天平：感量0Ol g。64组织匀浆机。65旋涡混合器。66冷冻离心机(最高转速大于1 000 rmin)。67聚丙烯离心管(50 mL)。68酸度计(o01)。69氮吹仪。610固相萃取仪
9、。7提取及净化71提取711动物肌肉组织、肝脏、肾脏称取均质试样50 g(精确到01 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 01 molL EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(512)，1 000 rmin旋涡混合1 rain，超声提取10 rain，10 000 rmin离心5 min(温度低于5)，提取三次，合并上清液。2GBT 213122007712牛奶和鸡蛋称取均质试样50 g(精确到001 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，用40 mL 01molL EDTAMcllvaine缓冲溶液(512)溶解，1 000 rmin旋涡混合1 rain，超声提取10 min，
10、10 000 rmin离心10 min(温度低于5)，取上清液。72净化HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)，使用时用6 mL甲醇洗涤、6 mL水活化。将71提取的溶液以2 mLmin3 mLmin的速度过柱，弃去滤液，用2 mL 5甲醇水溶液(513)淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6 mL甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用1 mL 02甲酸水溶液(514)溶解，1 000 rmin旋涡混合1 min，用于上机测定。73基质加标标准工作曲线的制备将混合标准工作液(5162)用初始流动相逐级稀释成25”gL1000 vgL的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品50 g，加
11、入标准系列溶液10 mL，按照71、72与试样同时进行提取和净化。8高效液相色谱一质谱质谱测定81 高效液相色谱条件811色谱柱：Waters ACQUITY UPLC“BEH C18柱(100 mmN21 mm，17 pm)或其他等效柱。812流动相：AE40+60甲醇一乙腈溶液(55)；BE02甲酸水溶液(514)梯度淋洗，参考梯度条件见表B1。813流速：02 mLmin。814柱温：40。815进样体积：20 pL。82质谱条件电离模式；电喷雾电离正离子模式(EsI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；分辨率：单位分辨率；其他参考质谱条件见附录A。9空白试验除不加标准外，均按上述步
12、骤进行测定。10结果计算与表述101定性标准1011保留时间试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在士25之内，参考保留时间见表B2。1012信噪比待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(Sm3)，定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10(sN10)。1013定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围。各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录c，附
13、录D。3GBT 213122007表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差I 相对离子车度 50 2050 1020 10l 允许相对偏差 土20 士25 30 50102结果计算与表述按式(1)计算喹诺酮类药物残留量。 cV1 000一 m1 000式中：X样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(Lgkg)；c测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)v定容体积，单位为毫升(mL)；m一样品称样量，单位为克(g)。11检出限、定量限与回收率111检出限动物组织中检出限(SN一3)：氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星均为10 pgkg，环丙沙星为
14、25 pkg，沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、吡哌酸为2o p妇，依诺沙星为30zgkg。鸡蛋和牛奶中检出限：氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星均为o5 pgkg，环丙沙星为12,ugkg，沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、吡哌酸为10 pgkg，依诺沙星为15”gkg。112定量限动物组织中定量限(SN一10)：氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星均为30 l-gkg，环丙沙星为8,ugkg，沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、吡哌酸为6tgkg，依诺沙星为10 I,gkg。鸡蛋和牛奶中定量限：氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、西诺沙
15、星、恩诺沙星、单诺沙星，洛美沙星、氧氟沙星均为2 Vtgkg，环丙沙星为4 ugkg，沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、吡哌酸为3“gkg，依诺沙星为519kg。11，3回收率回收率试验采用三个加标浓度，分别为检出限浓度的1、2、5倍。猪肉中14种喹诺酮的加标回收率在8681169之间，相对标准偏差(RSD)在19151之间；猪肝中14种喹诺酮的加标回收率在9021185之间，RSD在18141之间；猪肾中14种喹诺酮的加标回收率在8681131之间，RSD在2317o之间；牛奶中14种喹诺酮的加标回收率在79o1199之间，RSD在22194之间；鸡蛋中14种喹诺酮的加标回收率在8051121之
16、间，RSD在29201之间。具体见附录E。参考质谱条件：a) 电离源：电喷雾正离子模式b)毛细管电压：20 kV；c)射频透镜电压：0 V；d)源温度：110；e)脱溶剂气温度：350；f)脱溶剂气流量：500 Lh；g)电子倍增电压：650 V；h)喷撞室压力：028 Pa；i)其他质谱参数见表A1。附录A(资料性附录)参考质谱条件1表A1 14种喹诺酮的主要参考质谱参数GBT 213122007化合物 母离子 子离子 碰撞能量eV 锥孔电压V2711。 21 38吡哌酸 30431890 32 3829038 17 38堵氟沙星 33432332 25 383183 18 38氧氟沙星 3
17、6222612 27 3830334 19 50依诺沙星 32142339 22 5030233 19 50诺氟沙星 32032763 17 503143 19 36环丙沙星 33222883 17 3631645 19 38恩诺沙星 36033423 23 383403 25 38单诺沙星 3583820 42 382652 23 36洛美抄星 35233083 17 363423 18 40沙拉沙星 38632993 28 401)所列质谱参考条件是在Micromass。一Quattro Premier XE质谱仪上完成的，此处所列试验用仪器型号仅供参考，不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试
18、不同厂家或型号的仪器。5GBT 213122007表A1(续)化合物 母离子 子离子 碰撞能量eV 锥孔电压v24411 16 35西诺沙星 26311888 28 3524414 16 50奥索利酸 262 11559 28 502151 15 26萘啶酸 23311870 28 2624411 17 50氟甲喹 262 22021 28 50注：对不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。a定量离子。6附录B(资料性附录)参考液相条件表B1 分离14种喹诺酮的参考梯度条件GBT 213122007时问min 甲醇乙腈 02甲酸水O 10 906 30 709 50
19、5095 lOO 0105 100 011 10 9015 10 90表B2 14种喹诺酮的参考保留时间(RT)化合物 RTrain 化合物 RTrain恩诺沙星 584 洛美沙星 566诺氟沙星 508 吡哌酸 393培氟沙星 514 萘啶酸 1032环丙沙星 532 奥索利酸 867氧氟沙星 504 氟甲喹 1067沙拉沙星 674 西诺沙星 776依诺沙星 479 单诺沙星 564GBT 2131220078附录C(资料性附录)14种喹诺酮的子离子扫描质谱图34M2 1 36 8341 7341 63675、368 33684367 3342638 ；929298 6、 3685385
20、6、 ，386385 4、3862983、385 2、322 2。 2849 322113429 。F凳t艘 3017船誓mz图C1沙拉沙星二级质谱图氘361蛩 l3623j42611 r。 26061。Il 316 4。_Jl一 山mz图C2氧氟沙星二级质谱图GBIT 21312200734 393162316 6，359抄“3一。一34P譬艄霄鼹篱。JlILjJlIInjJIf襻j 一 zo。23赫。阳删17痢。甄Il：温誓mz图C3恩诺沙星二级质谱图8100110120130140150160170180190 200 210 220 230240 250 260270 2鲫290 30
21、0 310 320 330 340 350 360370mz图C4单诺沙星二级质谱图GBT 21312200710mz图C5洛美沙星二级质谱图mz图C6培氟沙星二级质谱图96GBT 2131220073142313828313 3,244 7287 8，2451，2452 28742885，15 42676268 3霉鼍。_。竺，。薅滔2041弧oui ；45 8坛68 4288 8I。L。“u。UdI皿圳_儿 矗脆293 599。42m，z图C7环丙沙星二级质谱图60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340mz图C8依诺沙
22、星二级质谱图GBT 213122007123”oa：2瞥05,2硎234,0204 Z2 II藏II 262潇0 i r12335l 2567 256 932。9，5J 1吨N1 q! n lmz图c9诺氟沙星二级质谱图mz图C10西诺沙星二级质谱图GBT 2131220072441，。一 一147肇80 1_72，518931594 眢。卜。215 N 。 l。AW“-i：f 1 JI 。mz图C11奥索利酸二级质谱图。 - 【V2441一202 Ol 2616 mz图C12氟甲喹二级质谱图13GBT 21312200714214 61867。 1 233o l50 60 70 80 90
23、100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240mj图C13萘啶酸二级质谱图mz图C14毗藤酸二级质谱图6附录D(资料性附录)14种喹诺酮标准溶液色谱图GBT 2131220071弧，：，一，一，一，一，一，一，X， oTrr11tr1T，-1TT，_1，r，T，-H1，f，Pr1，f，f1，r，rnll，十r，_，rrr_；一1，罂，一，一，一，一，一，一墨，一 0k1tnlr111甲Trnr11r，r”_r，_，T，T，T几，r1，f_0H，r一1瞿，墨型竺一，一，一，一，：酲，一，一，一一一 o1r11Tr1十r_1T
24、rhlTrr11TrP，_1_f_+；_rPTP1_r叶，rrrH，Tr一铤，!=一，一，一五，鬻，一，一，一， 瓷巳，0k，三辜L，+。一1黻，挲=一，一玉一，一，一一，一，一1鬏，!竺：，：定一一，一，。一，一，一，。一一， 4 oo 5 oo 6 oo 7 oo 8 00 9oo 10oo 1l oo1鬏，：=一，翼善錾一，一，一一，一一1，一，跫一一，一，一：=，一，一，一一， 4 oo 5oo 6oo 7 oo 8oo 900 10 oo 11oo图D1 14种喹诺酮标准溶液色谱圈15GBT 213122007附录E(资料性附录)五种基质中14种瞳诺酮的回收率和相对标准偏差表E1 猪
25、肉、猪肝、猪肾中喹诺酮的回收率及相对标准偏差(n=6)加标水平 猪 肉 猪 肝 猪 肾化台物(pgkg) 回收率 RSD 回收率 RSI) 回收率 RSD1 1108 52 1125 141 868 10 7氟甲喹 Z 】054 19 1087 101 1022 41S 1015 44 1024 24 942 36l 113 7 72 1155 4o 880 126萘啶酸 2 108 1 58 1058 28 1028 485 109 3 73 102，1 18 t034 40l 113 7 94 1lO5 61 1085 78奥索利酸 2 114 2 65 1153 58 1012 635
26、104，7 56 1125 34 1045 451 108 3 74 1112 75 932 13 0西诺沙星 2 1060 37 1145 52 1126 1065 】049 34 1130 53 1078 672 1160 34 1125 57 938 63沙拉沙星 4 1042 27 1091 76 94 6 5310 1115 60 1091 lo1 901 1041 1143 60 1185 95 108o lO3恩诺沙星 2 1073 36 1131 72 1077 735 1008 37 1114 5 6 907 861 978 77 1047 89 875 13 2单诺沙星 2
27、 968 43 1093 58 1065 655 90 2 35 10Z3 40 870 551 1088 108 1158 88 893 14O洛美沙星 Z 1082 lO9 llO7 8 4 1094 715 1085 44 1002 38 1007 23l 878 151 1148 75 908 170氧氟沙星 2 94，6 67 1128 58 1117 955 939 46 960 46 932 7825 1047 53 1069 59 1047 89环丙沙星 5 979 46 1062 48 1063 3 3125 868 64 1020 36 962 46表E1(续)GBT 21
28、3122007加标水平 猪 肉 猪 肝 猪 肾化合物(ugkg) 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD2 1068 4 2 1123 63 1113 101诺氟沙星 4 936 66 996 55 1058 6610 1115 10 2 902 59 89 1 1292 1169 103 1078 37 963 115培氟沙星 4 102 4 38 994 4 2 1092 4410 1049 116 1063 63 877 1062 107 4 41 1045 58 102 2 75吡哌酸 4 1026 2 2 1111 77 882 9810 92 3 147 1044 51 8
29、89 1053 92 2 57 102 3 112 1005 101依诺沙星 6 1022 32 1058 31 1131 6415 938 50 922 121 954 94表E2牛奶和鸡蛋中喹诺酮的回收率及相对标准偏差(n=6)加标水平 牛 奶 鸡 蛋化合物(pgkg) 回收率 RSD 回收率 RSD05 987 132 1018 58氟甲喹 l 970 16 1 1083 742 968 59 1003 3805 105 7 107 1077 54萘啶酸 1 953 105 1058 432 987 86 966 4205 1037 160 90o 96奥索利酸 l 978 117 11
30、07 842 971 51 1003 4205 877 11 1 108o 62西诺沙星 1 883 100 1057 762 98 2 7 5 950 501 95 3 7 2 805 130沙拉沙星 2 983 37 110 8 635 1008 22 1098 2905 1050 117 983 184恩诺沙星 1 973 97 1040 912 1017 66 984 5717GBT 213122007表E2(续)加标水平 牛 奶 鸡 蛋化合物(,gkg) 回收率 RSD 回收率 RSD05 983 109 1033 160单诺沙星 l 987 118 1065 1312 966 44
31、 976 7505 807 92 102 7 129洛美沙星 1 873 106 1053 1102 903 32 963 9505 1097 99 1017 154氧氟沙星 1 790 45 963 】392 876 91 971 9。2125 833 194 90。3 201环丙抄星 25 805 101 88 4 18950 101-7 91 937 1891 87O 10O 972 158诺氟沙星 2 836 44 965 1114 1027 46 1121 171l 948 121 905 200培氟抄星 2 gO3 101 908 1084 1044 78 916 194l 1160 86 943 199毗哌酸 2 1108 45 861 1034 1199 76 942 12615 872 133 952 148依诺沙星 3 797 98 900 1766 843 53 911 83
