1、ICS 67120X 04 瘩目中华人民共和国国家标准GBT 213132007动物源性食品中D一受体激动剂残留检测方法 液相色谱一质谱质谱法Analysis of p-agonists in foods of animal origin by high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry2007-1 0-29发布 2008-04-0 1实施宰瞀鹳鬻瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会“。刖 罱GBT 213132007本标准的附录A、附录B、附录c、附录D、附录E均为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监
2、督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人沼B兵、李晓娟、吴永宁、彭涛、孟娟、杨奕、代汉慧、国伟。本标准为首次发布。1范围动物源性食品中p受体激动剂残留检测方法液相色谱一质谱质谱法GBT 213132007本标准规定了p受体激动剂类兽药残留检测的制样方法和液相色谱一质谱质谱确证方法。本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品以及猪尿中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁等8种口受体激动剂类残留量的高效液相色谱一质谱质谱测定。2规范性引用文件下列文件中
3、的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-1992，neq ISO 3696：1987)3方法提要试样中B_受体激动剂残留经酶解后，再用高氯酸溶液提取，经过滤和离心后，上清液用HLB和MCX固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。4制样方法制样操作过程中应防止样品污染或残留物发生变化。41动物肌肉、肝脏、肾脏从所取
4、全部样品中取出有代表性样品约500 g，剔除筋膜，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18以下冷冻存放。42猪尿从所取全部样品中取出有代表性样品约500 g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18以下冷冻存放。5试剂和材料除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为GBT 6682规定的一级水。51甲醇。52高氯酸：分析纯。53氨水：分析纯(浓度2528)。54甲酸(99，ameisensaeure)。55氢氧化钠：分析纯。56乙酸：分析纯。57乙酸钠(NaAc4H20)：分析纯。58乙酸一乙酸钠缓冲溶液(pH 52)：称取430 g NaAc4H：O和
5、252 g乙酸，加水溶解并定容到100mL。1GBT 21313200759 01甲酸水溶液。510 5甲醇氨溶液：量取5mL氨水(53)，用甲醇定容至100mL。5”20甲醇水溶液。512 01 molL高氯酸。513 01 mmolL高氯酸。514葡糖醛酸苷肽酶芳基磺酸酯酶溶液(pglucuronidasearylsulfatase)(30 UmL)。515标准物质：妥布特罗(tulobuterol，CAS：41570-61-0)、特布它林(terbutaline，cAs：2303125-6)、沙丁胺醇(salbutamol，CAS：51022709)、非诺特罗(fenoterol，CAS
6、：1944123)、福莫特罗(formoterol，CAS：73573-87一z)、克伦特罗(clenhutero，cAS：37148-279)、莱克多巴胺(ractopamine，CAS：97825-25-7)、异丙喘宁(metaproterenol，CAS：586061)。纯度均大于等于99。516标准溶液5161标准储备溶液：准确称取克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁各0010 0 g，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，浓度为1 000 mgL，一18冰箱中保存，有效期12个月。5162标准工作液：根据需要，用甲醇将标准储备溶液(5161)配
7、制为适当浓度的标准工作液。标准工作液应使用前配制。517 HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL)或其他等效柱。518 MCX固相萃取柱(60 mg，3 mL)或其他等效柱。6仪器61 高效液相色谱一串联质谱仪。62电子天平：感量0000 1 g。63电子天平：感量001 g。64组织匀浆机。65旋涡混合器。66冷冻离心机(最大转速高于10 000 rmin)。67聚丙烯离心管(50 mL)。68酸度计(001)。69氮吹仪。610固相萃取仪。611超声清洗仪(功率5 w)。7提取爰净化71提取准确称取100 g样品，加入15 mL pH 52的乙酸一乙酸钠缓冲溶液(58)，1 000 rm
8、in匀浆1 min，再加人p葡糖醛酸苷肽酶芳基磺酸酯酶溶液100“L，于371振荡酶解过夜。取出冷却后，用高氯酸调pH值至10，超声振荡20 min，取出置于80水浴中加热30 min。放人冷冻离心机中，1010 000 rmin离心10 min。倾出上清液，残渣再用10 mL 01 molL高氯酸溶液提取一次，10 000 r111in离心。合并上清液。用1 molL氢氧化钠溶液调pH值至40，此溶液待过HLB固相萃取柱。72净化721 HLB柱净化HLB固相萃取柱(517)，使用前用6 mL甲醇、6 mL水活化。将71提取的溶液以2 mLmin3 mLmin的速度过柱，弃去滤液，用2 mL
9、 5甲醇淋洗，小柱抽干，再用6 mL甲醇洗脱。洗脱液用氮2GBT 213132007气吹至近干。用3 mL 01 ramolL高氯酸溶液溶解残渣，供MCX柱净化用。722 MCX柱净化MCX柱(518)，使用前用3mL 5甲醇氨、3mL甲醇、3mL水、3mL 01mmolL高氯酸(pH 4o)溶液活化。将721制得的溶液过柱，弃去滤液，依次用1 mL甲醇、1 mL 2甲醇水溶液淋洗，最后用7 mL 5甲醇氨洗脱，洗脱液用氮气吹近干后，用甲醇-01甲酸水(10+90)定容至10 mL，旋涡混合1 min，用于HPLC-MSMS测定。73基质加标标准工作曲线的制备将混合标准工作液(5162)用初始
10、流动相逐级稀释成05 FgL500-gL的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品100 g，加入标准系列溶液10 mL，按照71、72与试样同时进行提取和净化。8液相色谱一质谱质谱测定81液相色谱条件811色谱柱：ACQUITY UPLC“BEH C。柱(100 mmX 21 mm，17 pm)或其他等效柱。812流动相：甲醇一01甲酸水梯度淋洗，参考梯度条件见表B1。813流速：300 pLmin。814柱温：40。8。15进样量：10 pL。82质谱参考条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI-)；质谱扫描方式：多反应离子监测(MRM)；其他参考质谱条件见附录A。9定性91保留时间
11、试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在土25之内。各化合物的参考保留时间见表B2。92信噪比待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(SN3)，定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10(sN10)。93定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表l规定的范围。各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录c、附录D。表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差I 相对离子丰度
12、 50 2050 1020 lOll 允许相对偏差 20 土25 士30 5010定量按式(1)计算残留量： X=端1UUUmCBT 213132007式中：x样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(-gkg)；f测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y定容体积，单位为毫升(mL)；m样品称样量，单位为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。11方法的检出限和回收率111检出限按能够准确确认的目标化合物浓度来估计各目标化合物在不同样品基质的检出限，样品基质、取样量、进样量、色谱分离状况、电噪声水平以及仪器灵敏度均可能对样品检出限
13、造成影响，因此噪声水平应从实际样品谱图中获取。当某目标化合物的结果报告未检出时应同时报告样品检出限。克伦特罗、沙丁胺酵、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁在动物组织和猪尿中的检出限为010zgkg，定量限为030“gkg。”2回收率回收率试验采用三个添加浓度(01#gkg、05#gkg、20#gkg)计算方法的加标回收率。猪肉中8种p受体激动剂的加标回收率在863N1182之间，相对标准偏差(RSD)在46184之间；猪肝中8种p受体激动剂的加标回收率在8531197之间，RSD在29N147之间；猪肾中8种P受体激动剂的加标回收率在7751168之间，RSD在3o1
14、55之间；猪尿中8种p受体激动剂的加标回收率在7851135之间，RSD在322169之间。具体见附录E。12质量控制和质量保证121 精密度和准确度试验在分析实际试样前，实验室应达到可接受的精密度和准确度水平。通过对加标试样的分析，验证分析方法的可靠性。取不少于3份基质与实际试样相似的空白样品，分别加入标准溶液。将制备好的加标试样按上述方法进行分析，各目标化合物的回收率应在75125范围内，RSD小于20。在进行实际试样分析之前，应达到上述标准。当试样的提取、净化方法进行了修改以及更换分析操作人员后，应重复上述试验并直至达到上述标准。实验室每6个月应进行上述试验，并直至达到上述标准。如果可以
15、获得与试样具有相似基质的标准参考物，则可以用标准参考物代替加标试样进行精密度准确度试验。122方法空白每个批次最多15个样品，需做一次方法空白试验。123质控样品每个批次最多15个样品，需带一个质控样品。质控样品可以是标准参考物，也可以是已知浓度的加标样品。根据加标浓度，目标化合物的测定值应在标准值的75125范围之内。124保留时间窗口每100次进行窗13确定标准溶液的分析，确定保留时间窗口的正确。当更换色谱柱或改变色谱参数后均应使用窗口确定标准溶液对保留时间窗口进行校准。125质谱仪的质量数校正每周用校正液进行一次质谱仪的质量校正，确保监测离子的质量数不发生改变。4GBT 21313200
16、7126玻璃仪器的准备所有需重复使用的玻璃仪器应在使用后尽可能快地认真清洗，清洗过程如下：用该仪器接触过的最后一种溶剂冲洗；依次用己烷和丙酮冲洗；用含碱性洗涤剂的热水清洗；依次用热水和去离子水冲洗；依次用丙酮、己烷和二氯甲烷冲洗。使用加入含有碱性洗涤剂的热水的超声波清洗设备对清洗有很好的效果。如果使用刷子需特别注意不要划损玻璃仪器的表面。GBT 213132007参考质谱条件：a)毛细管电压：33 kV；b)锥孔电压：60 V；c)射频透镜1电压：40 v；d)射频透镜2电压：05 Ve)源温度：100；f)脱溶剂气温度：350；g)脱溶剂气流量：580 Lhh) 电子倍增电压：650 v；i
17、)喷撞室压力：028 Pa；j)其他质谱参数见表A1。附录A(资料性附录)参考质谱条件”表A1 8种p一受体激动剂主要参考质谱参数化合物 母离子 子离子 碰撞能量eV1937 12异丙喘宁 21181517 161517 16特布它林 22601698 1214784 18沙丁胺醇 24012219 1213484 18非诺特罗 30411070 181637 16莱克多巴胺 30212842 1220294 16克伦特罗 27712590 101490 14福莫特罗 34513271 181538 16妥布特罗 22791718 12注：对不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参
18、数优化到最佳。a定量离子。61)所列参考质谱条件是在Micromass一Quattro UltimaTMPt质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。附录B(资料性附录)参考液相色谱条件表B1分离8种p一受体激动剂的参考梯度条件GBT 213132007时间rain 01甲酸水 甲醇0 95 511 40 60111 95 515 95 5表B2 8种p一受体激动剂的参考保留时间(RT)化合物 RTrain异丙喘宁 189特布它林 267沙丁胺醇 282非诺特罗 362莱克多巴胺 536克伦特罗 603福英特罗 629妥布特罗
19、 6767GBT 2131320078附录C(资料性附录)8种p受体激动剂的子离子扫描质谱图5更474】彤28 1135 13j9142716毛”86卑21j ，!：；：。ij。!。，。l。，72二1三。号，图C1克伦特罗二级质谱图图C2非诺特罗二级质谱图GBT 21313200712n 9举6 m8 l嚆064。他l吡6 117是J 1尊9 燃2178l,617 2臻I_6”Im2 3187bq图C3福莫特罗二级质谱图图C4异丙喘宁二级质谱图9GBT 21313200710爆缸寸删。舻。b岛如l华81彳7 I577038m970 9|11投1衄9图C5莱克多巴胺二级质谱图151716c 72
20、07956870s740 858跨6 11&71昝6lm妒1 1529 。，。1。4。206：b-， 字“92449图C6特布它林二级质谱图GBT 213132007图C7妥布特罗二级质谱图14867973护6 105 8 17l碘俨5 尹k。篇一蛩墨图C8沙丁胺醇二级质谱图GBT 21313200712附录D(资料性附录)8种p一受体激动搁标准溶液色谱图1帮，笨一一一!：一一一一一一一一一1， 282 沙丁胺醇奄i，!S，、，、，一】， 267 特布它韩苇i，、，+，、，、，一1乳一跫一一=一一一一一一一一一1乳一一一笈一一一=：一一一一一，ool 6 福莫特罗,291钆一一一一笨一!竺一一
21、一一一一一1乳一一一一一，五一：竺一一一一一一一图D1 8种p一受体激动剂标准溶液色谱图附录E(资料性附录)p一受体激动剂的回收率和RSD表E1猪肉中p一受体激动剂的回收率和RSD(n=6)GBT 213132007加标水平01 pgkg 加标水平o5 pgkg 加标水平2o pgkg化合物回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RsD沙丁胺醇 952 67 998 88 973 1 o_O福莫特罗 865 99 913 98 971 80妥布特罗 1108 65 1082 65 1182 104克伦特罗 977 94 1109 72 1033 83莱克多巴胺 1092 124 1124 47
22、 1073 117非诺特罗 863 125 914 46 968 58特布它林 935 123 1172 46 967 64异丙喘宁 1055 184 975 101 1089 136表E2猪肝中p受体激动剂的回收率和RSD(n=6)加标水平o1 pgkg 加标水平05“gkg 加标水平20 pgkg化合物回收率“ RSD 回收率“ RSD 回收率 RSD抄丁胺醇 977 147 906 32 958 69福莫特罗 1170 29 1021 114 948 61妥布特罗 1197 36 943 50 942 71克伦特罗 923 11-5 911 74 926 93莱克多巴胺 988 103
23、915 58 894 48非诺特罗 993 94 923 59 954 64特布它林 952 145 897 37 884 49异丙喘宁 853 107 908 59 927 109表E3猪肾中p一受体激动剂的回收率和RSD(n=6)加标水平o119kg 加标水平05-gkg 加标水平20gkg化合物回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD沙丁胺醇 1013 122 1091 52 1146 92福莫特罗 963 75 1133 31 981 56妥布特罗 903 107 919 40 938 53克伦特罗 917 155 1168 30 898 61莱克多巴胺 813 113 931
24、48 963 56非诺特罗 1010 109 1130 52 1024 59特布它林 775 102 839 42 1082 51异丙喘宁 890 84 991 30 911 4213GBT 213132007表E4猪尿中p一受体激动剂的回收率和RSD(n=6)加标水平01“gkg 加标水平05 pgkg 加标水平20 pgkg化合物回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD沙丁胺醇 1097 88 951 22 948 56福莫特罗 1133 49 969 32 925 66妥布特罗 828 113 867 30 945 47克伦特罗 998 168 978 38 948 88莱克多巴胺 93Z 87 879 61 785 94非诺特罗 1135 72 928 46 954 53特布它林 1090 82 880 35 979 67异丙喘宁 1017 169 792 59 916 4414
