1、ICS 67120X 04 雪酉中华人民共和国国家标准GBT 213172007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱一质谱质谱法与高效液相色谱法Determination of tetracyclines residues in food of animal 0riginLC-MSMS method and HPLC method20071 0-29发布 2008-04-0 1实施丰瞀髅鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 舌GBT 213172007本标准的附录A、附录B和附录c为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：
2、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：岳振峰、谢丽琪、叶卫翔、吉彩霓、林秀云、邱月明、赵凤娟、陈沛金、周亚敏。本标准系首次发布。动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱一质谱质谱法与高效液相色谱法GBT 2131720071范围本标准规定了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测的制样方法、高效液相色谱检测方法和液相色谱一质谱质谱确证方法。本标准适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源性食品中二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素7种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺四环素、差向土霉素、土霉索、差向
3、四环素、四环素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素10种四环素类药物残留量的液相色谱一质谱质谱测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq ISO 3696：1987)3原理试样中四环素族抗生素残留用01 moL NazEDTA-Mcllvaine缓冲液(pH一40士
4、005)提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪或液相色谱电喷雾质谱仪测定，外标峰面积法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41 甲醇：高效液相色谱纯。42乙腈：高效液相色谱纯。43乙酸乙酯。44 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA2H。O)。45三氟乙酸。46柠檬酸(c6HsO，HzO)。47磷酸氢二钠(Naz HPO。-12HzO)。48柠檬酸溶液：01 molL。称取2101 g柠檬酸(46)，用水溶解，定容至1 000mL。49磷酸氢二钠溶液：02 molL。称取2841 g磷酸氢二钠(47)，用水溶解，定容至1
5、 000 mL。410 Mcllvaine缓冲溶液：将1 000 mL 01 molL柠檬酸溶液(48)与625 mL 02 molL磷酸氢二钠溶液(49)混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4o005。411 Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液：01 molL。称取605 g乙二胺四乙酸二钠(44)放人l 625 mL Mcllvaine缓冲溶液(410)中，使其溶解，摇匀。412甲醇+水(1+19)：量取5mL甲醇(41)与95mL水混合。1GBT 213172007413 甲醇+乙酸乙酯(1+9)：量取10 mL甲醇(41)与90 mL乙酸乙酯(43)混合。414 Oasis H
6、LB固相萃取柱：60 mg，3 mL，或相当者。使用前分别用5 mL甲醇和5 mL水预处理，保持柱体湿润。415三氟乙酸水溶液(10 mmolL)：准确吸取0765 mL三氟乙酸于1 000 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。416 甲醇+三氟乙酸水溶液(1+19)：量取50 mL甲醇(41)与950 mL三氟乙酸水溶液(415)混合。417 标准物质：二甲胺四环素(minocycline，CAS：10118908)，土霉素(oxytetracycline，CAS：6153-646)，四环素(tetracycline，CAS：60548)，去甲基金霉素(demeclocycline，CAS：
7、127333)，金霉素(chlortetracycline，CAS：5762 5)，甲烯土霉素(methaeycline，CAS：914001)，强力霉素(doxycycline，CAS：564250)，差向四环素(4-epitetracycline，CAS：64755)，差向土霉索(4epioxytetracycline，CAS：35259393)，差向金霉素(4-epichlortetracycline，CAS：14297939)。纯度均大于等于95。418标准溶液4181标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100质量的二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉
8、素、差向土霉素、差向四环素和差向金霉素各100 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度相当于100 mgL，储备液在一18以下贮存于棕色瓶中，可稳定12个月以上。4182混合标准工作溶液：根据需要，用甲醇+三氟乙酸水溶液(416)将标准储备溶液(4181)配制为适当浓度的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液应使用前配制。5仪器51 液相色谱串联四极杆质谱仪或相当者，配电喷雾离子源。52高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或紫外检测器。53分析天平：感量01 mg，001 g。54旋涡混合器。55低温离心机：最高转速5 000 rmin，控温范围为-40至室温。56吹氮浓缩仪。57固相萃取真
9、空装置。58 pH计：测量精度士o02。59组织捣碎机。510超声提取仪。6样品制备与贮存制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。61 动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品从所取全部样品中取出约500 g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18以下冷冻存放。62牛奶样品从所取全部样品中取出约500 g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18。C以下冷冻存放。GBT 2131720077测定步骤71提取711动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品称取均质试样5 g(精确到001 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，分别用约20 mL、20 mL、10
10、mL 01 molL EDTAMcllvaine缓冲溶液(411)冰水浴超声提取三次，每次旋涡混合1 min，超声提取10 rain，3 000 rrain离心5 rain(温度低于15)，合并上清液(注意控制总提取液的体积不超过50 mL)，并定容至50 mL，混匀，5 000 rrain离心10 min(温度低于15)，用快速滤纸过滤，待净化。712牛奶称取混匀试样5 g(精确到001 g)，置于50 mL比色管中，用01 molL EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(411)溶解并定容至50 mL，旋涡混合1 min，冰水浴超声10 rain，转移至50 mL聚丙烯离心管中，冷却至04
11、，5 000 rrain离心10 rain(温度低于15)，用快速滤纸过滤，待净化。72净化准确吸取10 mL提取液(相当于1 g样品)以1滴s的速度过HLB固相萃取柱(414)，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水(412)淋洗，弃去全部流出液。20 kPa以下减压抽干5 rain，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯(413)洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干(温度低于40。C)，用10 mL(液相色谱一质谱质谱法)或05 mL(高效液相色谱法)甲醇+三氟乙酸水溶液(4】6)溶解残渣，过045“m滤膜，待测定。73测定731液相色谱一质谱质谱法7311液相色谱条件a)色谱柱：Inerts
12、il C83，5 pm，150 mraX 21 ram(内径)，或相当者；b) 流动相：甲醇(41)+10 mmolL三氟乙酸(415)，梯度洗脱(梯度时间表见表1)；表1 分离10种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度时间min 甲醇 10 mmolL三氟乙酸0 50 95050 300 700100 335 665120 650 350175 650 35O18O 50 950250 50 950c)流速：300 pLmin；d)柱温：30；e)进样量：30“L。7312质谱条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式(EsI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；分辨率：单位分辨率；其他参考质谱条件
13、见附录A。7313定性测定73131保留时间待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在i25之内。3GBT 21317200773132信噪比待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(SN3)，定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10(SNlO)。73133定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差l 相对离子丰度 50 2050 10
14、20 10l 允许的相对偏差 士20 士25 土30 507314定量测定根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中四环素类兽药残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。各种四环素类药物的参考保留时间如下：二甲胺四环素96 rain，差向土霉素116 rain、土霉素118 rain、差向四环素109 rain、四环素119 min、去甲基金霉素146 nlin、差向金霉素138 min、金霉素157 rain、甲烯土霉素166 min、强力霉素167 rain。标准溶液的色谱图参见图B1。732高效液相色谱
15、法7321液相色谱条件a)色谱柱：Inertsil C83，5“m，250 mm46 ram(内径)，或相当者；b) 流动相：甲醇(41)+乙腈(42)+10 mmolL三氟乙酸(415)，洗脱梯度见表3(柱平衡时间5 rain)；表3分离7种四环素类药物的液相色谱流动相洗脱梯度时间rain 甲醇 乙腈 10 mmolL三氟乙酸0 1 4 955 6 24 709 7 28 6512 0 35 6515 0 35 65c)流速：15 mLmin；d)柱温：30；e)进样量：100“L；f)检测波长：350 nm。7322高效液相色谱测定根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标
16、准工作溶液。标准工作溶液和样液中四环素类兽药残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素的参考保留时间分别约为63 rain、75 min、79 rain、87 min、98 rain、104 min、108 rain，标准溶液的色谱图参见图B2。8空白试验除不如试样外，均按上述测定步骤进行。49结果计算与表述采用外标法定量，按式(1计算四环素类兽药残留量。vAxcsV“一砸了式中；x样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(-gkg)Ax测定液中待测组分的峰面积；c。标
17、准液中待测组分的含量，单位为微克每升(“gL)V定容体积，单位为毫升(mL)；As标准液中待测组分的峰面积；m最终样液所代表的样品质量，单位为克(g)。10测定低限、回收率和精密度GBT 213172007101测定低限1011液相色谱一质谱质谱法二甲胺四环素、差向土霉素、土霉素、差向四环素、四环素、去甲基金霉索、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素和强力霉索的测定低限均为500 pgkg。1012高效液相色谱法二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素和强力霉素的测定低限均为500 pgkg。102回收率和精密度方法的回收率和精密度的试验数据见表C1。GBT 2j3172007
18、附录A(资料性附录)参考质谱条件1参考质谱条件：a)雾化气(NEB)：600 Lmin(氮气)；b)气帘气(CUR)：1000 Lmin(氮气)c)喷雾电压(IS)：4 500 V；d)去溶剂温度(TEM)：500；e)去溶剂气流：700 Lmin(氮气)；f)碰撞气(CAD)：600 mLmln(氮气)g)其他质谱参数见表A1。表A，1 四环素类药物的主要参考质谱参数化合物 母离子(mz) 子离子(mz) 驻留时间ms 碰撞电压eV352 150 45二甲胺四环素 458441 4 50 27426 50 31差向土霉寨 461444 50 25426 50 27土霉素 461443 50
19、21410。 50 Z9差向四环素 445427 50 194108 50 29四环素 445427 50 19430 50 31去甲基金霉素 465448 50 25444 50 31差向金霉素 4794628 50 274443 50 33金霉素 479462 50 27381 150 33甲烯土霉素 4434261 50 25154 150 37强力霉素 44S428 4 50 29注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。3定量离子。61)所列参考质谱条件是在APl3000型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标
20、准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。附录B(资料性附录)多重反应监测(MRM)色谱图和液相色谱图量20001 1 9。J即 458352警 o1r1百t矿1互万1r五_旷1_犷姜-：10e40 0L：X，竺：型Lrrrrrrr，一暾 z q b 8 lO比14 lb ld zu zz z4，i辩4L强!：罂翌，竺：篝“oL丁T1r击1F面丽瓣0 04L ：弛粤翌一竺!掣l。一，一卫l一土!一一一一蠢z00：|0 ：竺l I，竺竺越LL一再 2 4 6 8 10m14 16 18 20 z2“争：L：坚芏!磐。竺：髂 2 4 6 8 10 1寻m116 18 20船4量1。e41 7 14 6a1
21、 5173 479444嚣00L1_1百可1F1r1七面_F丽争oL：一I：竺：嚣 oLrrFr1F1F1r1士1r1矿丽扣tT勰二薯i1盟一a 一竺竺警o oLL一屏 2 4 6 8埘1j，m背埘州加皑MGBT 213172007巳 1 957 458441i“器3=丢可七百矿矿m阿知ooLd!。；，竺：意”L一 挚：! 精 2 4 o 62 n14”“乳OO。e。4L：掣竺：嚣“00L丁1ri飞上百11r万五百萎OO。e4。L ：蔓L一竺二蓍“ooL丁1r百1可1F百面1丽。0L ：塑淄i二竺兰*!l，JLa，一8 2 4 6 8“ln“”“i3LT二可13 8毒1万之竺 i”。扯 ： 霉
22、：支15 73，竺竺哜 q o d z 州o u 川qimm羞t矧0一! 一工竺兰世oL，L，一器 z 4 6 8 lu lmll416 18 zu zz z4量3000】 9 16l” 441j428型o o !：!：骧J 硝 2 4 o 8州1再ml#仲埘洲列鹕L!：一：一竺：警oL且一2差向土霉索；3差向四环素；4四环索；5差向金霉素；6去甲基金霉素；7金霉素；8甲烯土霉素；9强力霉素；10土霉素。图B1 10种四环素类兽药残留标准溶液的重构离子色谱图7GBT 2131720078l一一二甲胺四环素2 土霉索；3四环素；4去甲基金霉素5金霉素；6一一甲烯土霉素；7一强力霉索。图B2 7种
23、四环素类兽药残留的标准溶液的液相色谱图洲。删州附录c(资料性附录)方法的回收率和精密度的试验数据表c1 方法的回收率和精密度的试验数据GBT 213172007样品 化合物 加标水平 高效液相色谱法 液相色谱一质谱质谱法种类 (tgkg) 回收率范围 相对标准偏差 回收率范围“ 相对标准偏差50o 94 o-109 4 7 91o938 51二甲胺四环素 100 96 4103 2 1 803913 41200 94 5995 1 7 805960 53800994 87差向土霉素 809904 40825915 30500 894106 57 704980 95土霉素 100 935102
24、25 80 2930 47200 935995 19 845945 31800926 49差向四环索 805873 24805910 36500 804924 47 802930 4 7四环素 100 816872 23 800867 28200 850935 32 82O965 59鸡肉80O942 49差向金霉素 805874 26800950 60500 804930 45 814948 55去甲基金霉素 100 80589 29 805897 32200 800890 3O 800940 5250O 802964 58 804922 49金霉素 100 80687 24 808904
25、37200 825910 30 810935 40500 808894 33 804930 45甲烯土霉紊 100 801857 22 802897 34200 800870 2 5 805885 28500 812936 47 800946 58强力霉素 100 808925 45 852942 30200 840935 35 840920 33GBT 213172007表c1(续)样品化合物 加标水平高效渡相色谱法 渡相色谱一质谱质谱法种类 (t_igkg) 回收率范围“ 相对标准偏差 回收率范围 相对标准偏差50，0 886-990 42 808936 55二甲胺四环素 300 9139
26、77 27 80398O 65600 943968 08 808977 68814107 90差向土霉素 850937 29802957 55500 848100 53 810988 67土霉素 300 913973 ZZ 873983 39600 808893 33 8089 o_5 41800932 51差向四环素 80391 7 50800883 34500 818101 71 802932 49四环素 300 80 7880 24 817953 51600 805860 21 815952 48鸡肝802960 60差向金霉素 800917 54800953 7O500 802984
27、70 804930 53去甲基金霉紊 300 803847 17 813943 60600 80Z838 15 800897 40500 806101 69 806107 100金霉索 300 8t3917 38 813907 40600 847917 25 815102 83500 800896 36 704980 88甲烯土霉紊 300 800853 22 820930 38600 805838 13 800848 20500 822918 35 802950 65强力霉紊 300 810853 18 803983 62600 805835 1 1 803952 5010表c1(续)GBT
28、 213172007样品 加标水平 高效液相色谱法 液相色谱质谱质谱法种类化合物(tgkg) 回收率范围 相对标准偏差 回收率范围 相对标准偏差“50 0 846102 70 88 4106 52二甲胺四环素 600 988103 15 802892 371 200 892953 25 803893 4580 8950 56差向土霉素 802862 27803843 l 750O 888103 41 742934 65土霉素 600 987103 14 80 2877 2 91 200 915997 27 767931 56804934 52差向四环素 800858 25801831 1150
29、0 864106 74 804980 72四环素 600 803842 15 813908 331 200 824883 21 78，3879 33猪肾81092O 51差向金霉素 80O848 2O800842 16500 804921 49 80 2964 5，3去甲基金霉素 600 800-832 13 802855 231 200 779849 3O 801836 1350O 802106 83 804950 59金霉紊 600 800842 17 802847 191 200 821916 33 80O848 1750，0 804992 77 800916 45甲烯土霉索 600 8
30、00852 21 800857 251 200 810888 27 800814 O6500 848105 74 806928 46强力霉素 600 897100 3 8 800865 241 200 819883 29 805832 1311cBJr 213172007表c1(续)样品 加标水平 高效液相色谱法 液相色谱质谱质谱法种类化合物(tzgkg) 回收率范围 相对标准偏差 回收率范围 相对标准偏差50O 924108 5 4 802106 91二甲胺四环素 100 773905 49 869981 42200 800925 45 885-104 5 2814988 52差向土霉素 8
31、01862 3O870102 59500 888108 58 73 0994 94土霉素 100 800998 7 5 806946 49200 810955 54 840106 7780693O 51差向四环素 800871 27855965 33500 812-948 65 802100 73四环素 100 805910 36 804961 65200 800885 33 875985 41鱼肉8】0922 49差向金霉素 805875 3184097O 5150，0 812938 51 80O946 50去甲基金霉素 100 805884 31 802865 29200 800870 2
32、7 830985 45500 804944 63 816948 49金霉素 100 801884 34 809885 28200 800970 3O 845985 53500 802912 43 80 2922 53甲烯土霉素 100 808897 30 801-848 16200 800855 24 805885 2 850 0 81O-100 68 808972 68强力霉素 100 809932 47 803889 36200 8e0905 4 3 80，5905 4112表C1(续)GBT 213j72007样品化合物加标水平 高效液相色谱法 液相色谱顺谱质谱法种类 (tjgkg) 回
33、收率范围 相对标准偏差 回收率范围 相对标准偏差50o 818100 6 8 810938 50=甲胺四环素 100 813890 30 803913 39200 815895 32 80596 0 3580O994 45差向土霉素 80 9904 32825915 33500 882109 70 704980 71土霉素 100 905997 31 802930 55200 905985 29 845945 35800926 51差向四环素 805873 39805910 75500 818996 7 1 802930 52四环素 100 809913 33 800867 42200 805
34、925 36 820965 42牛奶800942 44差向金霉素 805874 34800950 41500 81 6956 55 814948 5 5去甲基金霉素 100 802871 30 80589 7 28200 80O895 33 800940 28500 814988 63 804922 55金霉素 100 823935 40 808904 38200 800920 49 810935 22500 80495 6 54 804930 48甲烯土霉素 100 802876 33 80 2897 40200 805915 42 805885 19500 802950 6 3 800946 47强力霉素 100 842987 62 852942 46200 890101 41 840920 5513
