1、ICS 67120X 04 瘩雪中华人民共和国国家标准动物源食品中阿维菌素类药物残留的测定 酶联免疫吸附法Determination of avermectins residues in foodstuffs of animal 0riginEnzyme linked immunosorbent assay20071029发布 20080401实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局省士中国国家标准化管理委员会及伟刖 置GBT 213192007本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：沈建忠、史为民、万
2、宇平、何方洋、吴聪明、张素霞、冯才伟、彭涛、国伟。1范围动物源食品中阿维菌素类药物残留的测定酶联免疫吸附法CBT 213192007本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的酶联免疫吸附测定法。本标准适用于牛肉和牛肝中阿维菌素、伊维菌素和埃普利诺菌素残留量的测定。本标准的方法检测限：阿维菌素类药物在牛肝组织和牛肉组织中的检测限均为2zgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq ISO 3696：1987)3原理采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的阿维菌素类药物与酶标板上的偶联抗原竞争阿维菌素抗体，加入酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450 nm处测定吸光度，吸光值与阿维菌素类药物残留量成负相关，与标准曲线比较即可得出阿维菌素类药物残留含量。4试剂和材料41 阿维菌素类药物试剂盒411 96孔板(12条8孔)包被有阿维菌素偶联抗原。412阿维菌素标准溶液(至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白)。413阿维菌素抗体溶液
4、。414过氧化物酶标记物。415底物显色溶液A液：过氧化尿素。416底物显色溶液B液：四甲基联苯胺。417反应终止液：1 molL硫酸。418缓冲液(2倍浓缩液)。419洗涤液(20倍浓缩液)。42乙腈、正己烷、无水硫酸钠(分析纯)。43碱性氧化铝柱SepPak Vac 12 cc(2 g)。44水：GBT 6682规定的一级水。45缓冲液工作液：用水将2倍的浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液+1份水)，用于溶解干燥的残留物，缓冲液工作液在CC可保存一个月。46洗涤液工作液：用水将20倍的浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤，
5、洗涤工作液在4可保存一个月。】GBT 213192Q075仪器51酶标仪(配备450 nm滤光片)。52超声波清洗器。53离心机。54氮气吹干仪。55匀浆机。56振荡器。57涡旋式混合器。58微量移液器：单道20弘L、50弘L、100 pL，多道50 pL300 pL可调。6试样制备与保存取新鲜或解冻的动物组织，剪碎，10 000 rmin匀浆1 rain。一20下保存。7试样测定71提取称取牛肉、牛肝试样30 g005 g于50mL聚苯乙烯离心管中，加9mL乙腈、3mL正己烷，置于振荡器上振荡10min，加3 g无水硫酸钠，再振荡10rain，3 000 rmin以上，15C离心10min，
6、去除上层正己烷，取下层40 mL提取液备用。称取3 g无水硫酸钠平铺在碱性氧化铝柱Sep Pak Vac上，加10 mL乙腈洗柱，再加40 mI。提取液，开始收集滤液，待提取液流干后，再加入4mL乙腈清洗柱子，合并洗液和滤液至10mL干净的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干。取10 mL缓冲液工作液溶解干燥的残留物，涡动1 min，超声10 min，涡动l min。取溶解后的样品液100 pL加入100 pL缓冲液工作液，充分混合，取20 pL用于分析。72测定使用前将试剂盒在窒温(1925)下放置1 h2 h。721 将标准和试样(至少按双平行实验计算)所有数量的孔条插入微孔架，记录标准
7、和试样的位置。722加20 pL系列标准溶液(412)或处理好的试样溶液到各自的微孔中。标准和试样至少做两个平行试验。723加抗体工作液(413)80 pL到每一个微孔中，充分混合，于37恒温箱中孵育30min。724倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250 pL洗涤液工作液充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。725加100 pL过氧化物酶标记物(414)，37恒温箱中孵育30 min。726倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250 pL洗涤液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以
8、上(或用洗板机洗涤)。727加50 pL底物显色液A液(415)和50止底物显色液B液(416)，混合并在37恒温箱避光显色15 min30 rain。728加50 pL反应终止液(417)，轻轻振荡混匀，用酶标仪在450 nrfl处测量吸光度值。8结果计算用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式(1)：A，一晏100 (1)2GBT 213192007式中：A，相对吸光度值，；B标准(试样)溶液的吸光度值；B。一空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应阿维菌素(btgL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见式(2)：X一叁丕 m1000式中：x试样中阿维菌素类的含量，单位为微克每千克(bcgkg)；A一试样的相对吸光度值()对应的阿维菌素类含量，单位为微克每升(pgL)；，_一试样稀释倍数；m一试样的取样量，单位为克(g)。计算结果表示到小数点后两位。阳性结果应用确证法确证。9交叉反应阿维菌素：100；埃普利诺菌素：130伊维菌素：33；多拉菌素：5；泰乐菌素：O1；替米考星：01。10精密度本方法的批内变异系数30，批间变异系数45。
