1、 注 ICS 07.100.30 C 53 备案号： 14979-2004 浙江省地方标准DB33DB33/T 4732004- 内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类 链霉素型药物残留量的测定 放射免疫快速检测法 Determination of beta-lactam,sulfa drugs and aminoglycoside-St residues-Radioimmunoassay 2004-02-04 发布 2004-03-04 实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T 4732004 I 前 言 本标准由杭州市质量技术监督局、杭州市农业局共同提出。 本标准由杭州市农产品检测站负责起草。 本标
2、准由浙江大学动物科学学院、华粤行仪器有限公司参加起草。 本标准主要起草人：胡学肖、杨华、周方、袁谦、方维焕、邹黎明、李容、姚建红。 DB33/T 4732004 1 - 内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素 型药物残留量的测定 放射免疫快速检测法 1 范围 本标准规定了 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定方法。 本标准适用于牛乳及其制品（生鲜乳、灭菌乳、乳粉等）和畜、禽等动物肌肉及内脏中 -内酰胺类和磺胺类药物残留的测定，以及牛乳及其制品中氨基糖苷类链霉素型药物（链霉素、双氢链霉素、庆大霉素）残留的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款
3、。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验用水规格和试验方法 3 原理 样品中残留的药物和药片中标记了14C或3H的药物竞争结合其特异性受体， 经免疫竞争反应后离心，取沉淀物加入闪烁液，在液体闪烁计数器中计数 1 分钟，将计数值与标准溶液测定的计数值进行比较，计算待测样品中药物的残留量。 4 试剂和溶液 4.1 水 应符合 GB/T 6682 二级用水要求。 4.2 闪烁液 由放射免疫试剂盒公司提供。
4、 4.3 牛乳及其制品测定用 CHARM II 放射免疫试剂盒或其它公司同类产品 4.3.1 牛乳及其制品中 -内酰胺类药物测定用 放射免疫试剂盒。包括：绿色和黄 色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、青霉素 G 标准干粉等。 4.3.2 牛乳及其制品中磺胺类药物 测定用放射免疫试剂盒。包括：白 色和粉红色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、磺胺二甲嘧啶标准干粉等。 DB33/T 4732004 2 4.3.3 牛乳及其制品中氨基糖苷类 链霉素型药物测定用放射免疫试剂 盒。包括：白色和绿色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、链霉素标准干粉等。 4.3.4 牛乳阴性对照液配制：取出待测药物试 剂盒中的牛乳阴性对照浓缩干
5、 粉瓶，加入 100mL 40oC左右的水，震荡混匀，冷却至 07oC，备用。 4.4 动物组织测定用 CHARM II 放射免疫试剂盒或其它公司同类产品 4.4.1 动物组织中-内酰胺类药物测定用放射免疫试剂盒。包括：绿色和黄色药片、组织阴性对照浓缩干粉、青霉素G标准干粉、萃取缓冲液干粉和M2缓冲液干粉等。 4.4.2 动物组织中磺胺类药物测定 用放射免疫试剂盒。包括：白色和 粉红色药片、组织阴性对照浓缩干粉、磺胺二甲嘧啶标准干粉、萃取缓冲液干粉和M2缓冲液干粉等。 4.4.3 萃取缓冲液配制：取出待测药物试剂盒中的萃取缓冲液干粉瓶，将瓶中干粉全部转移入 1000mL容量瓶中，用水定容至刻度
6、，震荡混匀，备用。 4.4.4 M2 缓冲液配制：取出待测药物试剂盒中的 M2 缓冲液干粉瓶，加入 50mL 水，震荡混匀，备用。 4.4.5 组织阴性对照液配制：取出待测药物试剂盒中的组织阴性对照浓缩干粉瓶，加入 10mL水，震荡混匀，将其全部加入 30.0mL 萃取缓冲液（4.4.3）中，在锥形瓶中混合均匀，备用。 4.5 青霉素 G 标准溶液和阳性对照液配制 4.5.1 青霉素 G 标准溶液配制 4.5.1.1 青霉素 G 标准 贮备液：浓度为 1000ng/mL。 取出 -内酰胺类药物试剂盒（4.3.1或 4.4.1）中的青霉素 G标准干粉瓶，准确加入 10mL 水，震荡混匀，备用。
7、4.5.1.2 牛乳及其制品测定用青霉素 G 标准中间工作液：浓度为 50ng/mL。 吸取 2.0mL青霉素 G 标准贮备液（4.5.1.1） 和38.0mL 牛乳阴性对照液（4.3.4） ，在锥形瓶中混合均匀，备用。 4.5.1.3 牛乳及其制品测定用青霉素 G 标准工作液 吸取 1.5mL、2.5mL、5.0m L、7.5mL、10.0mL 青霉素 G 标准中间工作液（4.5.1.2） ，分别移至 25mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成 3，5，10，15，20ng/mL的标准系列。 4.5.1.4 动物组织测定用青霉素 G 标准中间工作液：浓度
8、为 50ng/mL。 吸取 3.0mL 青霉素 G 标准贮备液（4.5.1.1） 、27.0mL 组织阴性对照液（4.4.5）和 30mL 萃取缓冲液（4.4.3） ，在锥形瓶中混合均匀，备用。 DB33/T 4732004 3 4.5.1.5 动物组织测定用青霉素 G标准工作液 吸取 5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5m L、15.0mL 青霉素 G 标准中间工作液（4.5.1.4） ，分别移至 25mL容量瓶中，用萃取缓冲液（4.4.3）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成 10，15，20，25，30ng/mL 的标准系列。 4.5.2 青霉素 G 阳性对照液配制 4.5.2.1
9、 牛乳及其制品测定用青霉素 G 阳性对照液：浓度为 5ng/mL。 吸取 1.0mL 青霉素 G 标准中间工作液（4.5.1.2）和 9mL 牛乳阴性对照液（4.3.4） ，在小烧杯中混合均匀。 4.5.2.2 动物组织测定用青霉素 G阳性对照液：浓度为 12.5ng/mL。 吸取 0.3mL 青霉素 G 标准贮备液（4.5.1.1） ，加入到 5.7mL 组织阴性对照溶液（4.4.5）中，在小烧杯中混合均匀，然后从中吸取 2.0mL 混合溶液，加入到 6.0mL 萃取缓冲液（4.4.3）中，在小烧杯中混合均匀。 4.6 磺胺二甲嘧啶标准溶液和阳性对照液配制 4.6.1 磺胺二甲嘧啶标准溶液配
10、制 4.6.1.1 磺胺二甲嘧啶标准贮备液：浓度为 1000ng/mL。 取出磺胺类药物试剂盒（4.3.2 或 4.4.2）中的磺胺二甲嘧啶标准干粉瓶，准确加入 10mL 水，震荡混匀，备用。 4.6.1.2 牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧啶标准中间工作液：浓度为 50ng/mL。 吸取 3.0mL磺胺二甲嘧啶标准贮备液（4.6.1.1 ）和 57.0mL牛乳阴性对照液（4.3.4） ，在锥形瓶中混合均匀，备用。 4.6.1.3 牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧啶标准工作液 吸取 5.0mL、7.5mL、10.0mL、12 .5mL、15.0mL 磺胺二甲嘧啶标准中间工作液（4.6.1.2） ，分别
11、移至 25mL 容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成 10，15，20，25，30ng/mL 的标准系列。 4.6.1.4 动物组织测定用磺胺二甲嘧啶标准中间工作液：浓度为 50ng/mL。 吸取 3.0mL 磺胺二甲嘧啶标准贮备液（4.6.1.1） 、27.0mL 组织阴性对照液（4.4.5）和 30mL 萃取缓冲液（4.4.3） ，在锥形瓶中混合均匀，备用。 4.6.1.5 动物组织测定用磺胺二甲嘧啶标准工作液 吸取 5.0mL、7.5mL、10.0mL、12 .5mL、15.0mL 磺胺二甲嘧啶标准中间工作液（4.6.1.4） ，分别移DB33/T 4
12、732004 4 至 25mL 容量瓶中，用萃取缓冲液（4.4.3）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成 10， 15，20，25，30ng/mL的标准系列。 4.6.2 磺胺二甲嘧啶阳性对照液配制 4.6.2.1 牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧啶阳性对照液：浓度为 10ng/mL。 吸取 2.0mL 磺胺二甲嘧啶标准中间工作液（4.6.1.2）和 8mL 牛乳阴性对照液（4.3.4） ，在小烧杯中混合均匀。 4.6.2.2 动物组织测定用磺胺二甲嘧啶阳性对照液：浓度为 12.5ng/mL。 吸取 0.3mL 磺胺二甲嘧啶标准贮备液（4.6.1.1） ，加入到 5.7mL 组织阴性对照溶液（4.4.
13、5）中，在小烧杯中混合均匀，然后从中吸取 2.0mL 混合溶液，加入到 6.0mL 萃取缓冲液（4.4.3）中，在小烧杯中混合均匀。 4.7 链霉素标准溶液和阳性对照液配制 4.7.1 链霉素标准溶液配制 4.7.1.1 链霉素标准贮备液：浓度为 10000ng/mL。 取出氨基糖苷类链霉素型药物试剂盒（4.3.3）中的链霉素标准干粉瓶，准确加入 10mL 水，震荡混匀，备用。 4.7.1.2 牛乳及其制品测定用链霉素标准中间工作液：浓度为 100ng/mL。 吸取 0.5mL链霉素标准贮备液（4.7.1.1） ，加入到 50mL 容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均
14、匀，备用。 4.7.1.3 牛乳及其制品测定用链霉素标准工作液 吸取 2.5mL、5.0mL、7.5mL、10. 0mL、12.5mL 链霉素标准中间工作液（4.7.1.2） ，分别移至 25mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成 10，20，30，40，50ng/mL的标准系列。 4.7.2 链霉素阳性对照液配制 4.7.2.1 牛乳及其制品测定用链霉素阳性对照液：浓度为 25ng/mL。 吸取 2.0mL 链霉素标准中间工作液（4.7.1.2）和 6mL 牛乳阴性对照液（4.3.4） ，在小烧杯中混合均匀。 5 仪器和设备 5.1 CHARM II 6
15、600/7600 分析仪或其它同类产品。 5.2 分析天平：最小感量为 0.01g。 DB33/T 4732004 5 5.3 可调温加热器或水浴锅：20oC100oC（温度精度 0.1oC） 。 5.4 离心机：转速不低于 3300 转/分。 5.5 高速组织分散机：转速不低于 10000 转/分。 5.6 旋涡混合器。 5.7 普通冰箱：带冷冻室。 5.8 冰袋 5.9 连续可调移液器及配套吸头：200L1000L、1mL5mL。 5.10 专用试管及配套盖子： 13mm100mm，与分析仪配套。 5.11 脱脂棉签。 5.12 实验室常规玻璃器皿。 6 分析步骤 6.1 样品制备 6.1
16、.1 液态牛乳：采取具有代表性的液态牛乳（生鲜乳、 灭菌乳等）1000mL，放入冰箱中冷却至 07oC，密封保存，备用。生鲜乳保存期不超过 5天，灭菌乳保存期不超过其规定时间。 6.1.2 乳粉：采取具有代表性的样品 1kg，用四分法缩减至约 250g，混匀，装入样品瓶内室温下密封保存，备用。 6.1.3 动物组织： 采取具有代表性的样品 1kg， 放冰箱冷藏室中保存 （5 天内不测定的样品须冷冻保存） ，备用。 6.2 提取 6.2.1 液态牛乳：将待测牛乳混匀，取 20mL，测定前在 3300rpm 的转速下离心 5 分钟，去除上层脂肪，下层牛乳样品直接用于药物残留测定。 6.2.2 乳粉
17、：称取 2g 待测乳粉，加入 20mL 水，溶解混匀，冷却至 07oC，备用。全脂乳粉溶解混匀后，先在 3300rpm 的转速下离心 5 分钟，去除上层脂肪。 6.2.3 动物组织： 切下约 50g 全精肌肉或内脏， 将其剁碎或绞碎， 称取 10g 样品加入到 50mL 离心管中，同时加萃取缓冲液（4.4.3）至40mL刻度处。将离心管中的组织和缓冲液全部倒入小烧杯中，用高速组织分散机均质 1 分钟（处理不同样品时必须用水清洗分散头以避免交叉污染） 。将均质物摇匀后倒回原来的离心管中，将离心管放置在 80 2oC 的加热器中恒温规定时间（-内酰胺类药物 30 分钟，磺胺类药物 45 分钟） ，
18、取出后放置在冰水浴中冷却 10 分钟。将混合物在 3300rpm 的转速下离心 10 分钟，取上清液，用 M2缓冲液（4.4.4）将pH 值调至 7.5 左右，备用。 DB33/T 4732004 6 6.3 免疫竞争反应 将含有待测药物特异性受体的药片（颜色见表 1）放入到空试管（5.9）中，加 300L 水，旋涡混合约 10 秒钟。加入规定体积（体积见表 1）的试液（阴性对照液、阳性对照液、标准工作液、牛乳及其制品或动物组织样液） ，旋涡混合约 10 秒钟，立即加入含有14C或3H 同位素的药片（颜色见表 1） ，在旋涡混合器上混合约 15 秒钟；在规定温度（温度见表 1）下加热 3 分钟
19、，在 3300rpm 的转速下离心 3分钟。取出试管，弃去上清液，并用脱脂棉签擦去残留在试管壁上的脂肪和液滴（注意不要接触到沉淀物） 。加 300L 水，在旋涡混合器上将沉淀物打碎；最后加入 3.0mL 闪烁液，旋涡混合约 10 秒钟，并在试管上加上配套盖子，备用。 表 1 免疫竞争反应条件 药物类型 试液类别 受体药片 的颜色 同位素药片 的颜色 试液体积 加热温度 牛乳及其制品 绿色 黄色 5.0mL 85 1oC -内酰胺类 动物组织 绿色 黄色 2.0mL 55 1oC 牛乳及其制品 白色 粉红色 5.0mL 85 1oC 磺胺类 动物组织 白色 粉红色 4.0mL 65 1oC 氨基
20、糖苷类 链霉素型 牛乳及其制品 白色 绿色 5.0mL 35 1oC 6.4 测定 6.4.1 试剂和仪器有效性确认 检测阴性对照液和阳性对照液各 3次，求出其每分钟液体闪烁次数（CPM 值）的平均值，与试剂盒出厂计数单对比，阳性对照 CPM 平均值除以阴性对照 CPM 平均值应与出厂计数单上的比值相近，允许偏差为0.1，但不能超过 0.7（如超出允许范围，应重做或者与厂家联系） 。 6.4.2 测定 将标准工作液和待测样液依次在CHARM II 6600/7600分析仪或其它同类产品上进行60秒钟的读数，各读三次，分别记录每次的 CPM 值。测定 -内酰胺类药物时，读取14C频道上的 CPM
21、 值；测定磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物时，读取3H频道上的 CPM 值。 7 分析结果计算和表述 7.1 标准工作曲线绘制 以待测药物标准工作液的浓度值（C s）为横坐标，对应的 CPM 值（CPM s）为纵坐标，绘制标准工作曲线。 7.2 结果计算 样品中待测药物残留量(g/kg)按下式计算： DB33/T 4732004 7 待测药物残留量(g/kg)=VC/m 式中：C 由标准工作曲线求得的待测样液 CPM 值所对应的浓度，ng/mL； m 试样的质量，g； V 试样提取液体积，mL。 8 检出限与允许差 8.1 检出限 牛乳及其制品中 -内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物的检出限依次为 3g/kg、10g/kg、10g/kg；动物组织中 -内酰胺类和磺胺类药物的检出限分别为 10g/kg、10g/kg。 8.2 允许差 每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。 其分析结果的相对偏差应不大于 10%。 9 其他 本法为半定量快速测定法，当检验结果出现异议时，以国家标准方法为准。
