1、ICS67.04053备案 号： 浙 江 省 地 方 标 准 DB33DB3/T743-209水 产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定液相色谱 -串联质谱法Detrm inationofDiarheticShelfishpoisnigresiduesinfisheryproductsHPLC-MS/Sm ethod209-04-7发布 209-05-7实施浙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB33/T743 2009I前 言本标 准附 录 A为资 料性 附录 。本标 准 由浙 江省 水产 标准 化委 员会 提出 并归 口。本标 准起 草单 位： 浙江 省水 产质 量检 测中 心。 本标
2、 准主 要起 草人 ：张 海琪 、宋 琍琍 、施 礼科 、张 晓辉 、王 扬、 郑重 莺、 郑天 伦。DB33/T743 20091水产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定 液相色谱 -串联质谱法1范围 本 标 准 规 定 了 水 产 品 中 腹 泻 性 贝 类 毒 素 大 田 软 海 绵 酸 (Okadaicaid， 以 下 简 称 OA)和 鳍 藻 毒 素 -1(Dinophysitoxins-1，以 下简 称 DTX-1)的液 相色 谱 -串联 质谱 测定 法。本标 准适 用于 水产 品中 腹泻 性贝 类毒 素大 田软 海绵 酸和 鳍藻 毒素 -1残留 的测 定。本 标 准腹 泻性 贝 类毒素
3、 大田 软海 绵酸 和鳍 藻毒 素 -1的 定量 限均 为 0.02mg/kg。2规范 性引 用文 件 下列 文件 中的 条款 通过 本标 准的 引用 而成 为本 标准 的条 款。凡 是 注日 期的 引用 文件 ，其 随 后所 有 的修改 单 （ 不 包括 勘误 的内 容） 或 修 订版 均不 适用 于本 标准 ， 然 而 ， 鼓 励 根据 本标 准达 成协 议的 各方 研 究是否 可使 用这 些文 件的 最新 版本 。凡 是不 注日 期的 引用 文件 ，其 最新 版本 适用 于本 标准 。 GB/T6682分析 实验 室用 水规 格和 试验 方法SC/3024腹泻 性贝 类毒 素的 测定 生
4、物 法3原理试样 用甲 醇和 水混 合溶 液提 取， 三氯 甲烷 萃取 ，硅 胶固 相萃 取柱 净化 后， 液相 色谱 -串联 质谱 确证并定 性， 外标 法定 量。 4试剂 和材 料4.1水： GB/T6682规定 的一 级水 。4.2甲醇 ：色 谱纯 。4.3乙腈 ：色 谱纯 。4.4丙酮 ： 分析 纯。4.5正己 烷： 分析 纯 。4.6三氯 甲烷 ： 分析 纯 。4.7乙酸 ：优 质纯 。4.820%正己 烷丙 酮溶 液： 移 取 200m L正己 烷 ， 用丙 酮定 容至 1L。4.93%甲醇 丙酮 溶液 ：移取 30m L甲醇 ，用 丙酮 定容至 1L。4.1040%甲醇 丙酮 溶
5、液 ：移取 400m 甲醇 ，用 丙酮 定容至 1。4.1180%甲醇 水溶 液： 移取 800m L甲醇 ，用 水定 容至 1L。4.12大田 软海 绵酸 标准 品 （ CAS号： 78111-17-8，分 子式 ： C4H68O13）： 纯度 大于 97.5%。4.13鳍藻 毒素 -1标准 品（ 号： 81720-10-7，分 子式 ：457013） ： 纯度 大于 90%。4.14标准 储备 溶液 ： 分别 称取 经折 算相 当于 0.00100g的 标准 物 质（ 4.12和 4.13） 于 100m L容量 瓶中， 用甲 醇溶 解并 定容 至刻 度 ，使 各自 的浓 度均为 10 g
6、/m L， 避光 4 保存 。4.15空白 样品 提取 液： 用不 含腹 泻性 贝类 毒素 的水 产品 ，按照 6.2和 6.3制备 空白 样品 溶液 。4.16标准 工作 溶 液 ：根 据 需要 用空 白样 品溶 液将 标准 储备 溶液 稀释成 20ng/m L、 50ng/m L、 100ng/m L、200ng/m L、 400ng/m L的混 合标 准工 作溶 液，相 当 于样 品中 含有 0.02m g/kg、 0.05m g/kg、 0.1m g/kg、 0.2m g/kg、 0.4m g/kg大田 软海 绵酸 和鳍 藻毒 素 -1，现 配。4.17硅胶 固相 萃取 柱 ： 500
7、m g， 3mL， 或相 当 者 。DB33/T743200925仪器5.1液相 色谱 -串联 四极 杆质 谱仪 ：配 有电 喷雾 （ ESI）离 子源 。5.2电子 天平 ：感 量为 0.00001g和 0.01g。5.3组织 捣碎 机。5.4高速 匀浆 机： 20000r/m in。5.5涡旋 混合 器。5.6超声 波 发生 器 。5.7固相 萃取 装置 。5.8高速 离心 机： 10000r/m in。5.9氮 气 吹 干 仪 。5.10移液 器： 规格为 20 L200 L和 50 L1m。6测定 步骤6.1试样6.1.1取样按 SC/T3024中第 5章进 行取 样。6.1.2试样
8、制备 与保 存试样 用组 织捣 碎 机捣 碎后 ，再 用高 速匀 浆机 匀浆 ， 四分 法制 样 。 一 份用 作检 测， 另 一份 用作 备样 ，保存 于 -20 冰箱 中。6.2提取称取 试样 2g（精 确到 0.01g） ， 置 于 洁净 的离 心管 中， 加 入 80%甲醇 水溶 液 （ 4.11） 10m L， 超声 提取 5m in后 ， 6000r/m in离心 10m in。 重复 提取 一次 ，合 并上 层液 ，用 80%甲醇 水溶 液定 容至 25m 。 取二分 之一 的定 容 液于 另一 离心 管中 ，加 入 5m L正己 烷， 涡旋 混匀 ，分 层， 弃去 正己 烷层
9、，加 入 1m L水和 6m L三氯 甲烷 ，涡 旋混 匀， 分层 ，吸 取水 相于 另一 离心 管中 ，用 6m L三氯 甲烷 重复 萃取 二次 ，合 并三氯 甲烷 层， 于 60 水浴 氮 气 吹 干 仪 中用 氮气 流吹 至近 干。 残余 物用 1m20%正己 烷丙 酮溶 液 （ 4.8）溶解 ， 待净 化 。6.3净化依次 用 10mL丙酮 、 10mL甲醇和 10mL20%正己 烷丙 酮溶 液 （ 4.8） 活化 固相 萃取 柱， 然后 注入 提取液 （ 6.2） ， 然后 分别用 lm 20%正己 烷丙 酮溶 液 （ 4.8）和 10m L3%甲醇 丙酮 溶液 （ 4.9） 淋洗
10、。抽干 5m in后， 用 10m L40%甲醇丙酮 溶液（ 4.10） 进行洗脱 ， 收集洗脱液于 45 水浴、氮气流中吹干 。残余 物用 1.0m L80%甲醇 水溶 液 （ 4.11） 溶解 ， 混匀 ， 供测 试 。6.4测定6.4.1液相 色谱 条件6.4.1.1色谱 柱： C18柱， 150m m 2.1m m （ i.d.）， 5m ，或 相当 者；6.4.1.2柱温 ： 30 ；6.4.1.3进样 量： 10L；6.4.1.4流动 相： 0.1%乙酸 水溶 液 ： 乙腈 （ 30： 70， 体积 比 ） ；6.4.1.5流速为 250L/m in。6.4.2质谱 条件6.4.2
11、.1离子 源： 电喷 雾离 子源 （ ESI）；6.4.2.2扫描 方式 ：负 离子 扫描 ；6.4.2.3检测 方式 ：多 反应 监测 （ MR）；6.4.2.4离子 源温 度： 500 ；DB33/T743 200936.4.2.5雾化 气、 气帘 气、 碰撞 气、 辅助 加热 气均 为高 纯氮 气， 使用 前应 调节 各气 体流 量以 使质 谱灵敏度 达到 检测 要求 ； 6.4.2.6喷雾 电压 、去 簇电 压、 碰撞 能等 电压 值应 优化 至最 优灵 敏度 ；6.4.2.7定性 离子 对、 定量 离子 对、 去簇 电压 和碰 撞能 量见表 1。表 12种腹 泻性 贝类 毒素 的质
12、谱参 数6.4.3液相 色谱 -串联 质谱 测定根据 试样 中被 测样 液的 含量 情况 ，选 取 响应 值相 近的 标准 工作 液进 行色 谱分 析。以 定 量离 子峰 面 积为纵 坐标 ， 浓 度 为横 坐标 绘制 标准 工作 曲线 ， 得 到 标准 曲线 回归 方程 。 标 准 工作 液和 样液 待测 物的 响 应值均 应在 仪器 线性 响应 范围 内。 在 上 述色 谱条 件下 ， OA和 DTX-1的参 考保 留时 间分 别约 为 3.4m in和 5.7m in， 2种腹泻性贝类毒素的多反应监测（ MR）色谱图参见附录 A。外标法定量，超出线性范围则应稀释 后再 进样 分析 。6.
13、4.4定性 判定在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在 2.5%之内；且样品谱 图中 各组 分定 性离 子的 相对 丰度 与标 准溶 液谱 图中 定性 离子 的相 对丰 度进 行比 较，若 偏 差不 超过 表2规定 的范 围， 则可 判定 为样 品中 存在 对应 的待 测物 。 表 2定性 确证 时相 对离 子丰 度的 最大 允许 偏差6.4.5空白 实验除不 加试 样外 ，均 按上 述测 定条 件和 步骤 进行 。7结果 计算 样品中 OA或 DTX-1贝类 毒素 的残 留含 用色 谱数 据处 理机 或用 标准 曲线 按式 （ 1）进 行计 算。 （ 1）100
14、01000=mVcX式中 ： 样品中 OA或 DTX-1贝类 毒素 残留 量 ，单 位为 毫克 每千 克（ m g/kg） ；Xc 测试 液中 或 -1贝类 毒素 的浓 度， 单位 为微 克每 毫升 （ g/m L）；V 样品 定容 体积 ，单 位为 毫升 （ m L）；m 测试 液所 代表 样品 的质 量， 单位 为克 （ g）。8方法 回收 率 在 0.02m g/kg1.6m g/kg浓度 范围 内， 回收 率 在 75% 110%之间 。9方法 定量 限本方 法的 OA和 DTX-1的 定量 限均 为 0.02m g/kg。毒素 名称 英文名称 缩写 定性 离子对（ m /z） 定量
15、离子对（ m /z） 去簇电压 DP（ V） 碰撞能量 CE（ V）大田软海绵酸 OkadicaidOA803.6/25.0803.6/53.4803.6/25.0 -70-70 -60-68鳍藻毒素 -1Dinophysitoxins-1DTX-1817.4/25.0817.4/13.1817.4/25.0 -10-10 -68-94相对离子丰度（ %） 50 2050 1020 10允许的相对偏差（ ） 20 25 30 50DB33/T7432009410允许 差在重 复性 条件 下获 得的 两次 独立 测定 结果 的绝 对差 值不 得超 过算 术平 均值的 15%。DB33/T743 20095附录 A（资 料性 附录 ）腹泻 性贝 类毒 素多 反应 监测 （ MRM）色 谱图图 A.1OA、 DTX-1腹泻 性贝 类毒 素的 多反 应监 测（ MRM）色 谱图（ OA的保 留时间 3.4min，定 性离 子对 m /z803.6/255.0和 m /z803.6/563.4； DTX-1的保 留时间 5.7min，定性 离子对 m /z817.4/255.0和 m /z817.4/113.1）
