1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1486-2004 输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法Detecting methods for yellow fever virus in imported mosquitoes 2004-11斗7发布2005-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局SN/T 1486-2004 前言本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国陕西出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:张升、郑剑宁、俞雪钧、黄兴琪、黄廷学
2、、闰护森。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 1486-2004 输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法1 范围本标准规定了国境口岸输入性蚊类中携带的黄热病毒检测的检测对象、生物安全要求、检测方法、结果的报告及处置。本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带黄热病毒的检测和报告。口岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可参考本标准执行。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版
3、本造用于本标准。SN/T 1243 国境口岸黄热病检验规程WS 233 微生物生物医学实验室生物安全通用准则3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 输入性蚊类imported mquit侃S通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包携带入境的伊蚊属。3.2 黄热病毒yellow fever virus 为黄热病的病原体，属虫媒病毒中披膜病毒科黄病毒属。黄热病毒颗粒呈球形，直径22m38m，外有脂蛋白包膜包绕，包膜表面有刺突，病毒基因组为单股正链RNA。4 检测对象输入性蚊类中伊蚊属，主要为埃及伊蚊。5 实验室生物安全要求实验室生物安全要求见SN/T1243及WS233。下列操作必须
4、在生物安全3级(BSL-3)实验室进行:一一用蚊胸腔接种的方法分离病毒;一一一收集或浓缩病毒或其培养产物;一一溶解、固定或其他方法处理灭活的病毒;一一-可能产生含病毒气溶胶的样品处理;一一离心管和离心机转头的封闭和开启。SN/T 1486-2004 6 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)6. 1 器材与试剂6. 1. 1 器材PCR扩增仪及PCR管、电泳仪及电泳槽、微量移液器及吸头、紫外观测灯、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱(-80.C)、组织研磨器、电动匀浆器、台式高速离心机(10000 r/min)和离心管、旋涡混合器、倒置显微镜、剪刀、慑子、台式高速离心机和离心管。6.1.2 常用试剂
5、6. 1.2. 1 实验用水用于PCR(包括核酸抽提)所用的水应不含RNA酶。6. 1. 2. 2 BA斗稀释液Hanks液内含50mmol/L Tris (pH7. 6) , BSA , O. 35g/L碳酸氢铀，链霉素100g/mL，二性霉素1g/mL。6. 1. 2. 3 日qDNA聚合酶20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化c6. 1. 2. 4 TE辑冲液10 mmol/L , pH8. 0 Tris-HCl，加入1mmol!L EDT A。6.1.2.5 RNA抑制荆(RN副in)一20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。6. 1. 2. 6 dNTP 含dCTP、dGTP、d
6、ATP、dTTP各10mmol/L。6. 1.2.7 裂解液4 mol/L异硫氨酸脏，25mmol/L拘梅酸铀，pH7.0 , 0. 5%Sarkosyl及100mmol/L -琉基乙醇。6.1.2.8 TBE电泳缓冲液(5X浓缩液)Tris 54.0 g，棚酸27.5g , EDTA 2.9 g，加水溶解至1000 mL，用5mol/L盐酸调节至pH8.O. 6.1.2.9 PCR反应缓冲液终浓度为50mmol!L Tris-Cl，室温pH8.3 , 40 mmol!L , 6 mmol!L氯化馍，1mmol/L DTT, 0.1 mg/mL BSA或明胶队6. 1. 2.10 其他酣町三氯
7、甲烧混合液，异丙醇，澳化乙链，琼脂糖等。6. 1. 2. 11 引物引物可以直接使用试剂盒，按说明书进行操作，也可根据要求选择其中一对引物，其序列分别如下:a) 引物对1如下:上游引物VD8: 5 -GGG TCTCCTCT AACCTCT AG-3 ; 一一一下游引物NS5YF:5-ATGCAGGACAAGACAATGGT-3 b) 引物对2如下:一一一上游引物Vg228F : 5 -G AACACACAA TCGG AACAGCTG-3勺一一一下游引物Df229R:5人ATTCCGGCAGACGCACACCTT-3。6.2 操作方法6.2.1 样晶制备SN/T 1486-2004 6. 2
8、. 1. 1 样晶采集将采集的蚊虫样本用10%葡萄糖水喂养2d以上，待胃内血液全部消化后将其冷冻致死。分类、分雌雄编号，按30只50只为一组，置70.C的液氮或干冰中保存，在2d内送交实验室。6.2. 1. 2 样晶制备将待检蚊虫样本每组分别用含青、链霉素的无菌生理盐水清洗三次，每组蚊样加入2.0mL BA-1稀释液后，在组织研磨器中研磨或置电动匀浆器中匀浆20s30 s，使样品匀浆成糊状，1000 r/min离心3 min，取上清液作为样品。6.2.2 RNA抽提在Eppendorf管内加入蚊样匀浆100L及300L酣-三氯甲烧混合液，涡旋1昆匀30s后;加入等量异丙醇沉淀RNA，10000
9、 r/min离心3min，吸去上清，将RNA沉淀重悬于100L不含RNA酶的纯水中，立即用于RT-PCR检测，剩余样品置一80.C低温保存。6.2.3 变性和退火将1L(30ng)引物VD8与10L重悬于纯水的样品RNA混合，95.C加热2min，立即置冰浴后，低速离心约5s，使液体集中在底部。6.2.4 cDNA合成在上述反应管中加入四种三磷酸脱氧核甘酸(dNTP)各0.2mmol/L、20IU RNA抑制剂(RNasin) ，和2IU禽成髓细胞瘤病毒(AMLV)逆转录酶，42.C反应1h，以扩增出模板cDNA。反应结束后，70.C 10 min灭活逆转录酶，立即置冰浴。6.2.5 PCR扩
10、增DNA取4LcDNA和46L反应缓冲液混合，其中含2mmol/L氯化馍，四种三磷酸脱氧核甘酸(dNTP)各0.5mmol/L , 300 ng引物VD8和变性引物EMF1(5 -TGGATGACSACKGARGAYATG-3S=C, G;K=G, T;R=A, G; Y=C, T)及O.5 IU Taq DNA聚合酶。95.C变性5min.将1昆合物进行30个PCR循环，95.C30 s , 53.C 90 s，随后72.C聚合10min。将1/200PCR扩增产物引用引物VD8和NS5YF进行半嵌套式PCR扩增。经过变性步骤，进行25个循环扩增DNA，94.C30 s , 55.C 60
11、s和72.C 120 s，在72.C延伸12m巾，最后4.C保温。6.2.6 设立对照在下列操作中应设立对照:在样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照;一以感染黄热病毒的蚊虫匀浆提取RNA作为阳性对照;一一取正常未染毒的伊蚊匀浆提取RNA作为阴性对照;取等体积的水代替模板作为空白对照。6.2.7 琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含O.5g/mL澳化乙链，EB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和2L样品缓冲液?昆匀后力IJ人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用pUC19DNA/Msp( HpaII). 5 V /
12、cm电泳约0.5h，当澳酣蓝到达底部时停止。6.2.8 结果判定在紫外灯下观察核酸带并判断结果:一一-PCR后阳性对照会出现一条DNA片段带，阴性对照和空白对照没有该核酸带。DNA片段带的位置根据所选引物对的不同而不同。3 SN/T 1486-2004 一一-待测样品与阳性对照电泳后在相同位置出现特异性病毒核酸显色条带者为阳性。一一无核酸带或核酸带的大小不是相应bp数的为阴性。7 病毒分离鉴别与酶联免症眼附试验检测方法参见附录A。8 检测结果报告8. 1. 1 逆转录聚合酶链式反应法检测为阳性的，报告为检出黄热病毒特异性基因(RT-PCR法)。8. 1.2 血凝抑制试验(HI试验)检测阳性的，
13、报告为黄热病毒检测阳性(HI试验)。8. 1.3 ELISA双抗体夹心法检测结果阳性，报告为检出黄热病毒抗原(ELISA双抗体夹心法)。9 阳性结果处置采用RT-PCR法或其他检测方法进行检测，出现阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。确定阳性结果后应立即向上级主管部门报告。4 SN/T 1486-2004 附录A(资料性附录)黄热病毒的分离鉴别与酶联兔擅吸附试验检测法A.1 仪器、常用器材与试剂A. 1. 1 仪器超净工作台、蚊虫饲养箱、普通光学显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、解剖显微镜、微型研磨器、离心器与离心管、冷冻切片机、分析天平、离心机(4000 r/min)、微型振荡器
14、、煮沸消毒器、高压消毒器、370C恒温培养箱、370C650C可调试水浴箱、二氧化碳孵育箱、普通冰箱、低温冰箱(-800C)、液氮罐、滤器和微孔滤膜、玻璃蒸榴器或离子交换纯水器、一200C冷冻切片机、酶标检测仪等。A. 1.2 常用器材细胞培养瓶、滴头、多通道移液器、96孔微量板、40孔酶标板、洗板机、培养皿、医用脱脂棉、有盖玻瓶、加样器、Eppendorf管及一般实验室常用玻璃器材。A. 1.3 试荆A. 1.3. 1 C6/36细胞培养生长液:Leibovitz L15基础营养液内加10%膜蛋白陈，10%胎牛血清(FCS)及青霉素(100IU/mL) ，链霉素(100g/mL)，细胞维持液
15、加5%FCS。A. 1. 3. 2 底物TMB溶液:用二甲基亚枫(DMSO)将3，3，5，5人囚甲基联苯胶(TMB)配成10mg/mL 原液，40C保存。i临用前以拘橡酸-磷酸盐缓冲液(pH5.4)稀释成0.1mg/mL，每毫升内加入0.75%双氧水4.2L。此洛液应在1h内使用。A. 1. 3. 3 PBS-吐温洗涤液(PBS-T):氯化饷8g，磷酸二氧饵0.2g，磷酸氢二铀(NazHP04 12HzO) 2.9 g，氯化饵0.2g，吐温200.5 mL，迭氮铀0.2g，加双蒸水至1000 mL, pH7. 4，保存于40C冰箱中备用。A. 1. 3. 4 抗黄热病毒特异性抗体及酶标记抗体。
16、A. 1. 3. 5 抗黄热病毒单克隆抗体。A. 1. 3. 6 封闭液:PBS(内含1%去脂奶粉，0.1%吐温-20)A. 1. 3. 7 终止反应液:2mol/L硫酸。A. 1.3.8 ELISA实验洗液:0.01mol/L , pH7. 4 PBS内加0.1%吐温-20(PBS-T)。A. 1. 3.9 TE缓冲液:10 mmol/L Tris明HCl，1 mmol/L EDT A，取上述1mol/L Tris 10 mL, 取0.5mol/L EDTA 2 mL，加水至1000 mL，高压灭菌。A.2 病毒的分离和鉴定A.2.1 样晶采集同6.2.1.1.A.2.2 样品制备将待检蚊虫
17、样本每组用含10倍于常规细胞培养用量青、链毒素的无菌生理盐水漂洗三次，然后按每只蚊虫加0.04mL无菌生理盐水(内含青霉素1000 IU/mL，链霉素1000附/mL)，用玻璃研磨器制成匀浆，置40C作用4h8 h;以3000r/min离心10min，取上清掖用0.22m微孔滤膜滤器过滤后用于接种、分离病毒。5 SN/T 1486-2004 A.3 病毒分离培养A. 3.1 胸腔接种法将实验室内喂养羽化的正常伊蚊放在冰浴的试管里5min斗omin，待其不活动后，放在解剖镜下的载玻片上，以接种用注射针头刺入蚊虫体内。雌蚊注射部位是中胸前侧片的前部与气孔下部之间的膜。雄蚊是注入于其颈膜，一刺入蚊体
18、就将玻璃管刻有标记的部位置于解剖镜视野下，看到液柱时推动注射器的柱塞。当已达到接种的液体量，即对注射器的柱塞减压或稍向后拉。注意不要刺穿蚊体，并检查所接种的液体是否都注入蚊体。每只蚊接种0.17L后，用小慑子把蚊虫从接种用注射针头t取下，放入蚊笼中，置270C30oC培养10d，同时设置未染毒正常蚊虫作为对照组。A.3.2 细胞培养法将待检蚊虫匀浆接种C6/36细胞单层培养，每管接种100L，每份样品接种3管4管细胞，置280C培养，黄热病毒所致细胞病变表现为折光性增强、圆缩、脱落，可收取细胞培养上清液低温保存，供传代或作进一步鉴定之用。如未发现有上述变化，应于第7d取培养液重复冻融两次，取上
19、清液接种新鲜正常细胞，盲传3代后，仍无细胞病变的可判断为阴性。A. 3. 3 乳鼠脑内接种取待检蚊虫匀浆，在乙酿麻醉下注入3d4 d龄同窝乳鼠脑内，0.025mL/只，每份样品接种5只8只，在防蚊的条件下观察14d乳鼠，每天两次(接种后24h内死亡的，应判断为非病毒感染死亡，不必继续做病毒培养分离)。发现有松毛、震颤、步履蹒跚等症状，说明可能有病毒感染，应在其濒死前取病鼠脑组织制备匀浆或低温冷冻切片，用于进一步鉴定。盲传2代(盲传方法为:按无菌操作取出鼠脑组织，用pH7.2pH8. 0含血清或自蛋白的缓冲液制成10%脑悬液，脑内注射1d3 d龄乳鼠)后，未出现上述病变的，初步可判断为阴性。A.
20、4 病毒鉴定方法A. 4.1 病毒鉴别(血凝抑制试验，HI试验)A. 4. 1. 1 血凝素滴定每次进行血凝抑制实验前必须作血凝素滴定，50L的PBS或盐水加入96孔微量板A-H行的2孔12孔，被检病毒各50L分别加入A-H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50L，12孔为阴性对照。加50L的1%鹅红细胞于每一孔，注意从低浓度至高浓度加入。j昆匀、室温静止45min 60 min。完全血凝的最高稀释度的倒数为血凝滴度。完全凝集为+，不完全凝集+/一，无凝集为一。结果判定以+为作为一个血凝单位(HAU)，血凝抑制实验用4HAU。A. 4. 1. 2 血凝抑制试验(HI试验)阴性血清和阳性血
21、清作为对照。加PBS或生理盐水25L于96孔板的第B行至H行的每一孔。加1: 10稀释的标准血清50，uL于A行的每一孔。用多通道移液器从A行各孔取25L血清，倍比稀释至H排各孔，弃去25Lo25L被检病毒的4HAU抗原加至各孔，t.昆匀，室温静置15 min30 min，然后加50L的1%鹅红血球，室温静置30min60 min后观察结果。在阴性对照孔中RBC完全沉淀后判定血凝抑制效价。A. 4.1.3 结果判定阴性血清对照均无自凝现象，阳性血清对照应抑制相应血凝素凝集细胞。血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。6 一一血清抗体滴度4倍或以上
22、升高者为阳性。一一一血清抗体滴度4倍以下者为阴性。A.4.2 病毒抗原检测双抗体夹心酶联免擅眼附试验(ELlSA)A. 4. 2.1 包被抗黄热病毒抗体SN/T 1486-2004 将抗黄热病毒特异性抗体以50mmol/L , pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释为最适浓度，用于包被酶标板，用包被液将纯化的黄热病毒McAb(效价1: 10万)按1: 100稀释后，每孔中加100L，同时设正常小鼠腹水对照，370C1 h后置40C过夜。A. 4. 2.2 洗涤倒出孔内液体，用洗液(PBS-T)加入小孔，3min后倒出，拍干。如此反复洗涤三次，甩干酶标板。A.4.2.3 封闭每孔加入封闭液300L，370
23、C孵育1h后倒出。用PBS-T洗涤三次，方法同前。A. 4.2. 4 加入待测样晶每份样品(蚊虫匀浆、细胞上清液或鼠脑句浆)加两孔，每孔100L。同时将黄热病毒悬液(阳性对照)、未染毒蚊虫匀浆(阴性对照)和PB5-T洗液(空白对照)也各加两孔。在加样前，待测蚊虫匀浆的上清液以PBS-吐温液(0.5%吐温-20)室温处理15min30 min(可降低本底或提高试验的敏感性)。40C过夜或370C孵青3h，用PBS-T洗涤三次，方法同前。A.4.2.5 消除非特异性过氧化物酶每孔加100L0.1%的双蒸水(用双蒸水临用前配置)，370C反应15min，倒出孔内液体。用PB5-T洗涤三次，方法同前。
24、A. 4. 2. 6 加入酶标记的检测抗体在每孔中加入100L用PBS-T稀释(1: 10 000)的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗黄热病毒单克隆抗体，370C孵育1h。倒出孔内液体，用PB5-T洗撮三次，方法向前。A. 4. 2. 7 加底物TMB溶液每孔中加入100L双蒸水/3，3，5，5人四甲基联苯胶(TMB)底物溶液，室温下避光反应显色15 min。A. 4. 2. 8 加终止反应液当阳性对照充分显色，阴性对照无色时，立即于每孔中加入50L2 mol/L硫酸以终止反应。尽快用目测法定性，用酶标仪测各孔吸光度A值。A. 4. 2. 9 结果判定用酶标仪测量各孔在450nm波长时的吸光度
25、(A值)。以空白对照的吸光度校正零点。样品孔的A值(P)与阴性对照孔的A值(N)之比大于或等于2.1(即P/N二三2.1)判定为阳性。gON-uZHZm 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法SN/T 1486-2004 奇峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷峰印张o.75 字数15千字2005年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年2月第一版峙7G 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价8.00书号:155066 2-16085 SN/T 1486-2004
