1、 中华人民共和国国家标准GB 220312010中华人民共和国卫生部发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定 National food safety standard Determination of added citrate content in cheese and processed cheese products GB 220312010 I 前 言 本标准代替 GB/T 22031-2008干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定 酶-比色法。 本标准附录 A、附录 B为规范性附录。 本标准所代替标
2、准的历次版本发布情况为： GB/T 22031-2008。 GB 220312010 1 食品安全国家标准 干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定 1 范围 本标准规定了干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量（以柠檬酸计）的测定方法。 本标准适用于干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 原理 测定样品中总柠檬酸盐的含量，扣除原料带入样品中的柠檬酸盐的量（以 0.04倍乳糖换算），即为样品中添加
3、的柠檬酸盐含量。柠檬酸盐以柠檬酸计。 4 分析步骤 样品中的总柠檬酸盐的测定和含量计算按附录 A的规定执行。 样品中的乳糖的测定和含量计算按附录 B的规定执行。 5 分析结果的表述 样品中添加的柠檬酸盐含量按（ 1）式计算： wa=wc rwi（ 1） 式中： wa样品中添加的柠檬酸盐含量，以柠檬酸计，以质量分数（ %）表示； wc样品中总柠檬酸含量，单位为质量分数（ %）； wi样品中乳糖含量，单位为质量分数（ %）； r 原料乳清粉或乳粉中柠檬酸含量与乳糖含量的比率（柠檬酸 /乳糖） （ r = 0.04） 。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后两位。
4、 6 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 GB 220312010 2 附 录 A （规范性附录） 干酪及加工干酪制品中柠檬酸盐含量的酶法测定 A.1 范围 本标准适用于酶法测定干酪及加工干酪制品中的柠檬酸盐含量。 A.2 原理 柠檬酸盐裂解酶（ CL）将柠檬酸盐转化为草酰乙酸盐和乙酸盐，苹果酸脱氢酶（ MDH）和乳酸脱氢酶（ LDH）在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NADH）的存在下催化脱羧草酰乙酸盐以及脱羧产物丙酮酸盐，分别转化成 L-苹果酸和 L-乳酸。 NADH在反应中被氧化成了 NAD+。在 340 nm处测定样品溶液中 NADH的
5、吸光度差值，计算样品中柠檬酸盐的含量。 A.3 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的二级水。 A.3.1 三氯乙酸溶液（ 200 g/L）:称取 20 g三氯乙酸（ CCl3COOH）溶于水中，混匀，并定容至 100 mL。 A.3.2 氢氧化钠溶液（ 200 g/L）:称取 20 g氢氧化钠（ NaOH） ，用水溶解后转移至 100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.3 氢氧化钠溶液（ 40 g/L）:称取 4 g氢氧化钠（ NaOH） ，用水溶解后转移至 100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.4 氢氧化钠溶液（ 4 g/L）:称
6、取 0.4 g氢氧化钠（ NaOH） ，用水溶解后转移至 100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.5 氯化锌溶液（ 0.8 g/L）:称取 0.8 g氯化锌（ ZnCl2） ，用水溶解后转移至 1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.6 缓冲液（ pH 7.8）: 称 取 7.13 g双甘氨肽 (H2NCH2CONHCH2CO2H)，溶解于 70 mL水中，转移至 100 mL容量瓶中。用氢氧化钠溶液（ A.3.2）调节 pH至 7.8，加入 10 mL氯化锌溶液（ A.3.5）并定容至 100 mL。充分混合。储存在 0 4 的冰箱中，此溶液可以保存四周。 A.3.7 碳酸
7、氢钠溶液（ 4.0 g/L）:称取 4.0 g碳酸氢钠（ NaHCO3） ，用水溶解后转移至 1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.8 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NADH ）溶液:称取 50 mg 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（ C21H27N7O14P2Na2）和 100 mg碳酸氢钠（ NaHCO3） ，溶解于 10 mL水中。 A.3.9 硫酸铵溶液（ 422 g/L）:称取 42.2 g硫酸铵 (NH4)2SO4，用水溶解后转移至 100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.10 苹果酸脱氢酶（ MDH）和乳酸脱氢酶（ LDH）悬浊液:用硫酸铵溶液（ A.3.9）分别溶解苹
8、果酸脱氢酶（猪心， EC 1.1.1.37）和乳酸脱氢酶（兔肉， EC 1.1.1.27） ，使苹果酸脱氢酶（ MDH）的活性不低于 600 IU/mL和乳酸脱氢酶的活性不低于 1400 IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后，储存在 0 4 冰箱中，此溶液可以保存一年。 A.3.11 柠檬酸盐裂解酶（ CL）溶液:用 0 水溶解柠檬酸盐裂解酶（产气肠杆菌， EC 4.1.3.6） ，使柠檬酸盐裂解酶的活性不低于 40 IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后，储存在 0 4 冰箱中，此溶液可以保存一周；在 -20 冰箱中，可以保存四周。 A.3.12 柠檬酸标准溶液 （ 160 g/mL） :称取 175 m
9、g一水柠檬酸 （ C6H8O7H2O） ， 用水溶解后转移至 1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 GB 220312010 3 A.4 仪器和设备 A.4.1 天平：感量为 0.1 mg。 A.4.2 pH计：精度为 0.1。 A.4.3 粉碎机。 A.4.4 具塞刻度比色管： 10 mL，分度值 0.1 mL。 A.4.5 中速滤纸。 A.4.6 紫外可见分光光度计： 340 nm， 1 cm比色皿。 A.4.7 水浴锅 。 A.5 试样制备 A.5.1 干酪 除去干酪的外壳或发霉的表层，使试样具代表性。用粉碎机（ A.4.3）将试样粉碎，混匀。 A.5.2 干酪制品 选择具有代表性的
10、试样，用粉碎机（ A.4.3）粉碎，混匀。 A.6 分析步骤 A.6.1 试液制备 称取 1 g（精确至 0.0001 g）试样（ A.5），溶于 50 mL的温水（ 40 50 ）中，全部转移入 100 mL容量瓶中，冷却至 20 。再加入 10 mL三氯乙酸溶液（ A.3.1），用水定容，混合均匀后静置 30 min。用滤纸（ A.4.5）过滤，弃去初滤液约 10 mL。吸取 25 mL滤液于烧杯中，用氢氧化钠溶液（ A.3.3）调节滤液 pH至 4后，再用氢氧化钠溶液（ A.3.4）调节 pH至 8。将烧杯中的溶液转移入 100 mL容量瓶中，用水定容。同时做空白试验。 A.6.2 测定
11、 A.6.2.1 标准曲线的绘制 试剂在使用前恢复至室温。准确吸取 0.00 mL、 0.50 mL、 1.00 mL、 1.50 mL、 2.00 mL(相当于 0、 80、160、 200、 320g柠檬酸 )两组柠檬酸标准溶液（ A.3.12） ,分别置于 10 mL比色管（ A.4.4）中，各加入 1.00 mL缓冲液（ A.3.6） 、 0.10 mL NADH溶液（ A.3.8） 、 0.02 mL苹果酸脱氢酶（ MDH）和乳酸脱氢酶（ LDH）悬浊液（ A.3.10） ，摇匀。在 20 25 水浴锅（ A.4.7）中保持 5 min，用水定容至 5.00 mL。其中一组用 1 c
12、m比色皿（ A.4.6） ，以空气作参比，在波长 340 nm处测定各比色管内溶液的吸光度 A0。另一组各加入 0.02 mL的柠檬酸盐裂解酶（ A.3.11） ，混匀，在 20 25 水浴锅（ A.4.7）中保持 10 min，用 1 cm比色皿（ A.4.6） ，以空气作参比，在波长 340 nm处测定各比色管内溶液的吸光度 A10。根据（ 2）式计算吸光度 A，以柠檬酸含量为纵坐标，吸光度 A为横坐标，绘制标准曲线。 A=A0 A10（ 2） 式中： A0 柠檬酸盐裂解酶添加前的吸光度； A10 柠檬酸盐裂解酶添加后水浴 10 min的吸光度。 注： 如果吸光度降低超过 0.800，用水
13、溶液稀释样品和空白测试，重复 A.6.2.1步骤。 A.6.2.2 试液吸光度的测定 用移液管吸取两份 2.00 mL试液（ A.6.1） ，置于 10 mL比色管 (A.4.4)中。以下步骤同 A.6.2.1中“各加入 1.00 mL缓冲液（ A.3.6）绘制标准曲线”操作，在标准曲线上查出对应的柠檬酸含量。同时做空白试验。 A.7 分析结果的表述 GB 220312010 4 样品中柠檬酸的含量按式（ A.2）计算。 X =423110000 VVmVVc（ 3） 式中： X 样品中柠檬酸的含量，单位为克每百克（ g/100g） ； c标准曲线上查出的试液中柠檬酸的含量，单位为微克（ g）
14、 ； m试样的质量，单位为克（ g） ； V1 试样经脱蛋白处理后的定容体积，单位为毫升（ mL） ； V2 吸取滤液体积，单位为毫升（ mL） ； V3 滤液定容体积，单位为毫升（ mL） ； V4 吸取试液体积，单位为毫升（ mL） 。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 A.8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 GB 220312010 5 附 录 B （规范性附录） 干酪及加工干酪中乳糖含量的酶法测定 B.1 范围 本标准适用于酶法测定干酪及加工干酪制品中的乳糖含量。 B.2 原理 在 -半
15、乳糖苷酶（ -GLS）催化下，乳糖被酶解为 D-葡萄糖（ G）和 D-半乳糖（ GL）。己 糖 激 酶（ HK）将 D-葡萄糖磷酸化生成 6-磷酸葡萄糖（ G6P），同时将三磷酸腺苷（ ATP）转化为二磷酸腺苷（ ADP）。受 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（ G6PDH）催化， 6-磷酸葡萄糖氧化为 6-磷酸葡萄糖酸（ GA6P），同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADP+）被还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH）。在波长 340 nm处 NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。 C12H22O11（ L） + H2O -GLS D-C6H12O6（ G） + D-C6
16、H12O6（ GL） D-C6H12O6（ G） + ATP HK G6P + ADP G6P + NADP+ H2O G6PDH GA6P + NADPH + H+B.3 试剂和材料 除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的二级水。 B.3.1 乳糖标准物质（ C12H22O11 H2O） ，纯度 99 %。 B.3.2 亚铁氰化钾溶液 (36 g/L)：称取 3.6 g亚铁氰化钾 K4Fe(CN)63H2O，用水溶解，定容至 100 mL，混匀。 B.3.3 硫酸锌溶液（ 72 g/L） ：称取 7.2 g硫酸锌（ ZnSO47H2O） ，用水溶解，定容至
17、100 mL，混匀。 B.3.4 硫酸溶液（ 2 mol/L） ：量取 60 mL硫酸，缓缓注入适量水中，冷却至室温后用水稀释至 1000 L，混匀。 警告 ：稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断搅动。否则会引起爆炸。 B.3.5 氢氧化钠溶液（ 200 g/L） ：称取 20.0 g氢氧化钠（ NaOH） ，用水溶解，定容至 100 mL，混匀。 B.3.6 氢氧化钠溶液（ 4 g/L） ：称取 4.0 g氢氧化钠（ NaOH） ，用水溶解，定容至 1000 mL，混匀。 B.3.7 硫酸铵溶液 (422 g/L)：称取 42.2 g硫酸铵 (NH4)2SO4，用水溶解，定容至 100
18、 mL，混匀。 B.3.8 柠檬酸盐缓冲液（ pH 6.6） ：分别称取 2.8 g柠檬酸钠（ C6H5O7Na32H2O） ， 0.042 g柠檬酸（ C6H8O7H2O）和 0.635 g七水硫酸镁（ MgSO47H2O）溶于 40 mL水中，用硫酸溶液（ B.3.4）或者氢氧化钠溶液（ B.3.6）调节 pH至 6.60.1后，用水定容至 50 mL，混匀后放置 0 4 冰箱中贮藏，可保存三个月，使用前放置至室温。 B.3.9 三乙醇胺（ TEA）缓冲液（ pH 7.6） ：分别称取 14.0 g盐酸三乙醇胺（ C6H15NO3HCl） ， 0.25 g七水硫酸镁（ MgSO47H2O）
19、 ，用 80 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（ B.3.5）调节 pH至 7.60.1后，定容至 100 mL，混匀后放置 0 4 冰箱中贮藏，可保持两个月。 B.3.10 NADP+ ATP TEA缓冲悬浊液：分别准确称取 65 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠（ C21H26N7O17P3Na2）和 170 mg 5-三磷酸腺苷二钠盐（ C10H14N5O13P3Na2） ，溶于 30 mL的三乙醇胺缓冲液（ B.3.9）中，混匀后放置 0 4 冰箱中贮藏可保持两周，使用前放置至室温。 GB 220312010 6 B.3.11 -半乳糖苷酶 -硫酸铵 -GLS-(NH4)2SO4悬浊液 (p
20、H约为 7.6)：将 -半乳糖苷酶 (-GLS，埃希氏大肠杆菌， EC 3.2.1.23)溶于硫酸铵溶液（ B.3.7）中，使 -半乳糖苷酶的活性不低于 60 IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后放置 0 4 冰箱中，可保存 12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。 B.3.12 己糖激酶 -6-磷酸葡萄糖脱氢酶硫酸铵 HK-G6PDH-(NH4)2SO4悬浊液：将己糖激酶（ HK，酵母， EC 2.7.1.1)和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（ G6PDH，酵母， EC 1.1.1.49）溶于硫酸铵溶液（ B.3.7）中，使己糖激酶活性不低于 280 IU/mL（ 25 ） ， 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活
21、性不低于 140 IU/mL（ 25 ） 。缓慢搅匀成悬浊液后放置 0 4 冰箱中，可保存 12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。 B.3.13 乳糖标准溶液（ 80 g/mL） ：精确称取经 87 烘烤 2 h至恒重的乳糖标准物质（ B.3.1） 0.842 g，溶于水中，定容至 100 mL，摇匀。准确吸取 1.00 mL上述溶液，用水稀释到 100 mL，即得浓度为 80 g/mL乳糖标准工作溶液。该溶液放置 0 4 冰箱中，临用前配制。 B.4 仪器和设备 B.4.1 天平：感量为 0.1 mg。 B.4.2 定量滤纸：中速，直径 15 cm。 B.4.3 比色管： 10 mL，
22、带盖。 B.4.4 分光光度计： 340 nm， 1 cm比色皿。 B.4.5 水浴锅：能在 20 36 保温。 B.5 分析步骤 B.5.1 试样制备 取有代表性的样品至少 200 g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。 B.5.2 试液的制备 准确称取 1 g样品于烧杯。用温水（ 40 50 ）溶解，玻璃棒搅拌，将烧杯中样品完全转移至 100 mL容量瓶，用水定容，混匀。加入 5 mL亚铁氰化钾溶液（ B.3.2）、 5 mL硫酸锌溶液（ B.3.3）和 10 mL NaOH溶液（ B.3.6），每次添加后充分混合溶液，用水定容至 100 mL，混合均匀后静置 30 min。过滤，弃去开始的
23、部分滤液。吸取 5.00 mL滤液于 100 mL容量瓶中，用水定容至 100 mL，即为试液。 B.5.3 标准曲线的绘制 用微量移液管吸取 0.00， 0.20， 0.40， 0.60， 0.80， 1.00 mL(相当于 0,16,32,48,64,80g乳糖 )乳糖标准溶液（ B.3.13），分别置于比色管（ B.4.3）中，各加入 0.20 mL柠檬酸盐缓冲溶液（ B.3.8）、 0.05 mL-半乳糖苷酶 -硫酸铵悬浊液 (B.3.11)，摇匀，于水浴锅（ B.4.5）中恒温 15 min。取出后加入 1.00 mL NADP+ ATP TEA缓冲溶液（ B.3.10）， 0.05
24、 mL己糖激酶 -6-磷酸葡萄糖脱氢酶硫酸铵悬浊液（ B.3.12），摇匀，于水浴锅（ B.4.5）中恒温 60 min。取出后，冷却至室温，用水定容至 5.00 mL，摇匀，放置 5 min。用 1 cm比色皿（ B.4.4），以乳糖标准溶液含量为零的试剂溶液作参比，在波长 340 nm处测定各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。 B.5.4 试液吸光度的测定 准确吸取 1.00 mL 试液（ B.5.2）于比色管（ B.4.3）中，加入 0.20 mL 柠檬酸盐缓冲溶液（ B.3.8） ， 1.00 mL NADP+-ATP-TEA 缓冲溶液（ B.3.
25、10） ， 0.05 mL 己糖激酶 -6-磷酸葡萄糖脱氢酶硫酸铵悬浊液（ B.3.12） ，摇匀，于水浴锅（ B.4.5）中恒温 60 min。取出后，冷却至室温，用水定容至 5.00 mL，摇匀，放置 5 min，作为试液参比溶液。 准确吸取 1.00 mL 试液（ B.5.2）于比色管（ B.4.3）中。以下按 B.5.3“各加入 0.20 mL 柠檬酸缓冲溶液（ B.3.8）放置 5 min”操作，用 1 cm 比色皿（ B.4.4） ，在波长 340 nm 处测定各比色管内溶液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量。 B.6 分析结果的表述 GB 220312010 7 试样中乳糖
26、的含量按式（ 4）计算。 X =423110000 VVmVVc （ 4） 式中： X 试样中乳糖的含量，单位为克每百克（ g/100g） ； c 标准曲线上查出的试液中乳糖的含量，单位为微克（ g） ； m 试料的质量，单位为克（ g） ； V1试料经脱蛋白处理后的定容体积，单位为毫升（ mL） ； V2吸取滤液体积，单位为毫升（ mL） ； V3滤液定容体积，单位为毫升（ mL） ； V4吸取试液体积，单位为毫升（ mL） 。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 B.7 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。
