1、 中华人民共和国国家标准 蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定方法 GB/T 13110-91 Method for determination of tetracyclines residue in honey 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物管碟法测定蜂蜜中四环素族抗生素残留量的方法。 本标准适用于天然或加工蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定。 2 原理 样品中四环素族抗生素经 Mcllvaine 缓冲液提取后 ,用 SEP-PAK C18 柱纯化。四环素族三 种抗生素四环素、土霉素及金霉素利用薄层层析生物检测法进行分离和定性；以蜡样芽胞 杆菌为试验菌株, 用微生物管碟法进行定量检测
2、。 3 试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 3.1 Mcllvaine 缓冲液(pH 4) ：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O)27.6g、柠檬酸 (C6H8O7 H2O)12.9g、乙二胺四乙酸二钠盐 37.2g，用水溶解后稀释并定容至 1000mL。 3.2 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH4.5)：称取磷酸氢二钾 13.6g,用水溶解后稀释并定容至 1000 mL,115灭菌 30 min，置 4冰箱中保存。 3.3 5%乙二胺四乙酸二钠盐水溶液。 3.4 Waters SEP-PAK C18 柱 (或国产 PT-C18 柱 )： 用时先经 10mL 甲醇滤过活化 ,
3、再用 10mL蒸 馏水置换，然后用 10mL 5%乙二胺四乙酸二钠盐流过。 3.5 标准抗生素：四环素、土霉素，金霉素标准品由卫生部药品生物制品检定所提供。 3.6 抗生素标准原液和稀释液 3.6.1 抗生素标准原液配制：精确称取四环素，土霉素、金霉素标准品适量( 按效价进行 换算) ，用 0.01 mol/L 盐酸溶解并定容至 1000 g/mL，置 4冰箱中( 可使用 7 天 )。 3.6.2 抗生素标准稀释液配制：临用前取上述原液按 1:0.8 剂距用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 逐步稀释配制成标准稀释液。制备四环素、土霉素标准曲线的标准浓度为 0.16,0.21,0.26 0.32
4、,0.40,0.50 g/mL,参考浓度为 0.25 g/mL；制备金霉素标准曲线的标准浓度为 0.033 0.041,0.051,0.064,0.08,0.10 g/mL,参考浓度为 0.05 g/mL。定性试验用标准液浓度四 环素，土霉素为 2 g/mL，金霉素为 1 g/mL。 3.7 展开剂：正丁醇- 醋酸- 水 (4： 1： 5)。 4 仪器 4.1 隔水式恒温箱。 4.2 冰箱 :0 4 。 4.3 恒温水浴。 4.4 高压灭菌器。 4.5 旋转式减压蒸馏器。 4.6 离心机：2000r/min 。 4.7 天平：感量 0.1mg。 4.8 层析缸：内长 20cm、宽 15cm、高
5、 30cm。 4.9 长方形培养皿：1.5cm 8cm 23cm。 4.10 层析纸：7cm 22cm，中速滤纸。 4.11 微量注射器：10 L、 50 L。 4.12 电吹风机。 4.13 游标卡尺。 4.14 吸管：容量为 1mL 和 10mL，标有 0.1mL 单位刻度。 4.15 注射器：容量为 20mL。 4.16 平皿：内径为 90mm，高 16 17mm，底部平整光滑，具陶瓷盖。 4.17 不锈钢小管( 简称小管) ：内径 6.0 0.1mm，外径 7.8 0.1mm，高度 10 0.1mm。 5 培养基 5.1 菌种培养基： 胰蛋白胨 10.0g； 牛肉浸膏 5.0g; 氯化
6、钠 2.5g; 琼脂 14 16g; 蒸馏水 1000mL 。 将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110 灭菌 30min，最终 pH 值为7.2 7.4。 5.2 检定用培养基： 胰蛋白胨 5.0g； 牛肉浸膏 3.0g； 磷酸氢二钾 3.0g； 琼脂 14 16g； 蒸馏水 1000 mL。 将 上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110 灭菌 30min，最终 pH 值为 6.5 0.1。 6 试样处理 6.1 定量试验用样液制备：称取混匀的蜂蜜样品 10.0g，加入 30mL pH4.0 的 Mcllvaine 缓 冲液，搅拌均匀，待溶解后进行过滤，滤液分数次置于注射器
7、中，用经预处理的 SEP-PAK C18 柱滤过，用 50mL 水洗柱，再用 10mL 甲醇洗脱，洗脱液经 40减压浓缩蒸干后，准确加 入 PH4.5 磷酸盐缓冲液 3 4mL 溶解，备定量检测用。 6.2 定性试验用样液制备：称取蜂蜜样品 5g,按 6.1 步骤处理，甲醇洗脱液经 40减压浓 缩蒸干后，用 0.1mL 甲醇溶解，备定性试验用。 7 菌液和检定用平板的制备 7.1 试验菌种：蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus var.mycoides) ，菌号 63301，由卫生部 药品生物制品检定所提供。 7.2 菌液的制备：将菌种移种于盛有菌种用培养基的克氏瓶内，于 37培养 7
8、 天，使镜检 芽胞数达 85%，先用 10mL 灭菌水洗下菌苔，离心 20min，弃去上清液，重复操作一次，再加 10mL 灭菌水于沉淀物中，混匀。然后，将此芽胞悬浮液置 65恒温水浴中加热 30min，从 水浴中取出, 于室温下放置 24h，再于 65恒温水浴中加热 30min，待冷后置 4冰箱保存。 用时可取此芽胞悬液以灭菌水稀释 10 倍成稀菌液。 7.3 芽胞悬液用量的测定： 把不同量的稀菌液加入检定用培养基中, 按本法进行操作， 0.25 g/mL 的四环素参考浓度可产生 15mm 以上的清晰、完整的抑菌圈，选择出最适宜的 芽胞悬液用量。一般为每 100mL 检定用培养基加入 0.2
9、 0.5mL 稀菌液。 7.4 检定用平板的制备：试验用平皿内预先铺有 20mL 检定培养基作为底层，将适量稀 菌液( 已于 7.3 中确定) 加到溶化后冷却至 55 60的检定用培养基中，混匀后往上述平 皿内加入 5mL 作为菌层。前后摇动平皿，使菌层均匀覆盖于底层表面，置水平位置上， 盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置 6 个小管，使小管在半径 2.3cm 的圆 面上成 60角的间距。所用平板须当天准备。 8 定量试验 8.1 标准曲线的制备：取 3 个检定用平板为一组，6 个标准浓度需要六组，在该组每个检 定用平板的 3 个间隔小管内注满一参考浓度液，在另 3 个小管内注满一
10、标准浓度液，于 37 1培养 16h，然后测量参考浓度和标准浓度的抑菌圈直径，求得各自 9 个数值的平均值,并 计算出各组内标准浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值 F，以标准浓度 C 为纵坐标，以 相应的 F 值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。 8.2 样品测定： 每份样品取 3 个检定用平板, 在每个平板上 3 个间隔的小管内注满 0.25g/mL 四环素参考浓度 (或 0.25 g/mL 土霉素或 0.05 g/mL 金霉素，视所含抗生素种类而定), 另 3个 小管内注满被检样液，于 37 1培养 16h，测量参考浓度和被检样液的抑菌圈直径，求得 各自 9 个数值的平均值，并计算
11、出被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值 Ft。 9 定性试验 取层析用滤纸(7cm 22cm)均匀喷上 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH4.5) ，于空气中晾 干、备用。在距滤纸底边 2.5cm 起始线上, 分别滴加 10 L 2 g/mL 四环素、土霉素及 1g/mL 金霉素标准稀释液与定性试验样液，将滤纸挂于盛有展开剂(3.7) 的层析缸中，以上行法 展开，待溶剂前沿展至 15cm 处将滤纸取出，于空气中晾干，贴在事先加有 60mL 含有试验用 菌菌层的长方形培养皿上,30min 后移去滤纸，在 37 1培养 16h，由抑菌圈测得比移值， 以确定被检样品中所含四环素族抗生素的种类。
12、 10 样品中四环素族抗生素残留量计算 根据被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值 Ft，从该种抗生素标准曲线上 查出抗生素的浓度 ct( g/mL)，样品中若同时存在二种以上四环素族抗生素时，除了四环 素、金霉素共存以金霉素表示结果外，其余情况均以土霉素表示结果。样品中四环素族抗 生素残留量按下式进行计算： ct V 1000 X= m 1000 式中: X 样品中四环素族抗生素残留量,mg/kg; ct检定用样液中四环素族抗生素的浓度，g/mL; V待检定样液的体积，mL; m样品质量，g 。 附加说明： 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准由福建省食品卫生监督检验所，福建省药品检验所负责起草。 本标准主要起草人林升清、马赛骏、黄宏南、耿莹莹、林桂生。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部 1991-06-07 批准 1992-03-01 实施
