1、lCS 65120B 46 蝠园中华人民共和国国家标准GBT 178122008代替GBT 17812-19992008-12-31发布饲料中维生素E的测定【j同 效液相色谱法Determination of vitamin E in feedsHighperformance liquid chromatography2009-05-0 1实施丰瞀徽鬻瓣警襻瞥霎发布中国国家标准化管理委员会况111刖 吾GBT 178122008本标准代替GBT 178121999(饲料中维生素E的测定高效液相色谱法。本标准与GBT 17812一1999相比主要变化如下：原标准方法为第一法皂化提取法(仲裁法)；
2、补充第二法直接提取法(快速法)，适用于维生素预混料中维生素E的测定。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SACTC 76)提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心(北京)，北京桑普生物化学技术有限公司，广东爱保农科技有限公司，帝斯曼维生素(上海)有限公司。本标准主要起草人：赵小阳、施文娟、虞哲高、吴革华、李俊玲、李永才、张进。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 178121999。饲料中维生素E的测定高效液相色谱法GBT 1781220081范围本标准规定了饲料中维生素E的测定高效液相色谱法。本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲
3、料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素E(dla一生育酚)的测定，定量限为1 mgkg。本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素E(dl一”生育酚乙酸酯)的测定，定量限为20 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。GBT 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GBT 603-2002，ISO 63531：1982，NEQ)GBT 6682分析
4、实验室用水规格和试验方法(GB，1T 6682 2008，ISO 3696：1 987，MOD)GBT 146991饲料采样(GBT 146991 2005，IsO 6497：2002，IDT)GBT 20195动物饲料试样的制备(GBT 20195-2006，IsO 6498：1998，IDT)3第一法皂化提取法(仲裁法)31原理用碱溶液皂化试验样品，使试样中天然生育酚释放出来，添加的dla一生育酚乙酸酯转化为游离的dln一生育酚，乙醚提取，蒸发乙醚，用正己烷溶解残渣。试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在280 nm处测定，外标法计算维生素E(dla一生育酚)含量。32试剂和溶液除特殊注明
5、外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GBT 6682中三级用水规定，色谱用水符合GBT 6682中一级用水规定，溶液按照GBT 603配制。321碘化钾溶液：100 gL。322淀粉指示液：5 gL。323硫代硫酸钠溶液：50 gL。324无水乙醚：不含过氧化物。3241过氧化物检查方法：用5 mL乙醚加1 mL碘化钾溶液(321)，振摇l mln，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加淀粉指示液(322)，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。3242去除过氧化物的方法：乙醚用硫代硫酸钠溶液(323)振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5部分，收集馏出的乙醚，再检查
6、过氧化物，应符合规定。325无水乙醇。326正己烷：色谱纯。GBT 178 122008327 1，4一二氧六环。328甲醇：色谱纯。329 2，6一二叔丁基对甲酚(BHT)。3210无水硫酸钠。3211氢氧化钾溶液：500 gL。3212 L-抗坏血酸乙醇溶液：5 gL。取05 g L-抗坏血酸结晶纯品溶解于4 mL温热的蒸馏水中，用无水乙醇(325)稀释至100 mL，临用前配制。3213维生素E(dlq一生育酚)对照品：dz一口-生育酚含量99o。3214 dla一生育酚标准贮备液：称取dla一生育酚对照品(3213)100 mg(精确至0000 01 g)于100 mL棕色容量瓶中，用
7、正己烷溶解并稀释至刻度，混匀，4保存。该贮备液浓度为10 mgmL。3215 dza一生育酚标准工作液：准确吸取dz一”生育酚标准贮备液(3214)，用正己烷(326)按1：20比例稀释。若用反相色谱测定，将10mL df一”生育酚标准贮备液置入10mL棕色容量瓶中，用氮气吹干，用甲醇(328)稀释至刻度，混匀，再按比例稀释，配制工作液浓度为50 ftgmL。3216酚酞指示剂乙醇溶液：10 gL。3217氮气(纯度999)。33仪器和设备331分析天平，感量分别为0000 1 g、0000 01 g。332圆底烧瓶，带回流冷凝器。333恒温水浴或电热套。334旋转蒸发器。335超纯水器。33
8、6高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。34采样按照GBT 14699I的规定执行。35试样制备按照GBT 20195制备试样，磨碎，全部通过028mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。36分析步骤警告在通风柜内操作1361试样溶液的制备3611皂化称取试样配合饲料或浓缩饲料i0 g，精确至0001 g，维生素预混料或复合预混料1 g5 g，精确至0000 1 g，置人250 mL圆底烧瓶中，加50 mL L-抗坏血酸乙醇溶液(3212)，使试样完全分散、浸湿，置于水浴上加热直到沸点，用氮气吹洗稍冷却，加10 mL氢氧化钾溶液(32ii)，混合均匀，在氮气流下
9、沸腾皂化回流30 min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5 mL无水乙醇(325)、5 mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40。3612提取定量的转移全部皂化液于盛有100mL无水乙醚(324)的500mL分液漏斗中，用30mL50mL蒸馏水分2次3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗，加盖、放气，随后混合，激烈振荡2 rain，静置、分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100 mL、60 mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用蒸馏水每次100 mL洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水2GBT 178122008硫酸钠(321
10、0)脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mg BHT(329)使之溶解，用乙醚定容至刻度(V。)。3613浓缩从乙醚提取液(V，)中分取一定体积(K)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空、水浴温度约50的条件下蒸发至干或用氮气吹于。残渣用正己烷溶解(反相色谱用甲醇溶解)，并稀释至10 mL(Va)使获得的溶液中每毫升含维生素E(dla一生育酚)50 pg100 pg，离心或通过045 pm过滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。362测定3621色谱条件36211正相色谱色谱柱：硅胶Lichrosorb Si60，长126 rflPFi，内径46
11、mm，粒度5 gm；流动相：正己烷+1，4一二氧六环一97+3；流速：10 mLmin；温度：室温；进样量：20 pL；检测器：紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)，检测波长280 nm。36212反相色谱色谱柱：c，8型柱，长125 mm，内径46 muD，粒度5 pm；流动相：甲醇+水一95+5；流速：10 mLmin；温度：室温；进样量：20 pL；检测器：紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)，检测波长280 iRm。3622定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素E(dla一生育酚)标准工作液(3215)和试样溶液(3613)，得到色谱峰面积响应
12、值，用外标法定量测定。3623结果计算36，231试样中维生素E的含量(x，)，以质量分数国际单位(或毫克)每千克(IU或mgkg)表示，按式(1)计算。v PlVlV3尸1“1一P2Xml X V2f式中：P， 试样溶液(3613)峰面积值；V， 提取液(3612)的总体积，单位为毫升(mL)；U一一试样溶液(3613)最终体积，单位为毫升(mL)；n 标准工作液(3215)浓度，单位为微克每毫升(pgmL)；P： 标准工作液(3215)峰面积值；m， 试样质量，单位为克(g)；yz 从提取液(V，)中分取的溶液体积，单位为毫升(mL)；，一一转换系数，1 IU维生素E相当于0909 mg
13、dla一生育酚，或136232平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。0 mg dl一生育酚乙酸酯。GBT 17812200836233重复性：同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。表1dhr生育酚含量 相对偏差(mgkg) 110 士2010 土104第二法直接提取法(快速测定法)41原理维生素预混料中的维生素E(dzn一生育酚乙酸酯)用甲醇溶液提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器(或二极管矩阵检测器)在285 rim处测定，外标法计算维生素E(dba生育酚乙酸酯)含量。42试剂和溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GBT 6682中三级用
14、水规定，色谱用水符合GBT 6682中一级用水规定。421 维生素E(dlp生育酚乙酸酯)对照品：dld一生育酚乙酸酯含量990。422维生素E(dl a一生育酚乙酸酯)标准贮备液：称取dla一生育酚乙酸酯(421)100 mg(精确至0000 01 g)，于100mL棕色容量瓶中，用甲醇(328)溶解并稀释至刻度，混匀，4保存。该贮备液浓度为10 mgmL。423维生素E(dl一”生育酚乙酸酯)标准工作液：准确吸取dla一生育酚乙酸酯标准贮备液(422)10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇(328)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为100 ggmL。43仪器和设备431超声波水浴。43
15、2其他同33。44采样l司34。45试样制备同35。46分析步骤461试样溶液的制备称取试样1 g，精确至0000 1 g，置于100 mL的棕色容量瓶中，加入约80 mL的甲醇，瓶塞不要拧紧，于60超声波水浴中超声提取30 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀。如果试样中维生素E(dln一生育酚乙酸酯)的标示量低于10 gkg，则将溶液过045 pm滤膜，进样测定，否则需将溶液用甲醇进一步稀释，使维生素E(d一a一生育酚乙酸酯)的进样浓度在lO pgmL120 vgmL之间。462测定4621色谱条件色谱柱：c18型柱，长150 mm，内径46 mm，粒度5 vm；流动相：甲醇+水
16、一98+2；流速：10 mLmin；温度：室温；进样量：20 pL；检测器：紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)，检测波长285 nlri。4622定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素E(din一生育酚乙酸酯)dGBT 178122008标准工作液(423)和试样溶液(461)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。4623结果计算46+231试样中维生素E的含量(xz)，以质量分数国际单位(或毫克)每千克(IU或mgkg)表示，按式(2)计算。 墨=糍(2)式中：P3试样溶液(461)峰面积值；V试样溶液(461)的总稀释体积，单位为毫升(mL)；一一标准工作液(423)浓度，单位为微克每毫升(tgmL)；P一一标准工作液(423)峰面积值；mz试样质量，单位为克(g)；，2转换系数，1 IU维生素E相当于o909 mg dla一生育酚，或10 mg dla一生育酚乙酸酯。46232平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。46233重复性：同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10。
