1、ICS 65.120 B 46 道昌中华人民=l:I工/、和国国家标准GB/T 17817-2010 代替GBjT17817 1999 饲料中维生素A的测定高效液相色谱法Determination of vitamin A in feeds High-performance liquid chromatography 2010-09-26发布2011-01-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 17817-2010 目U昌本标准代替GB/T17817一1999(饲料中维生素A的测定高效液相色谱法。本标准与GB/T17817一1999主要差异
2、如下:一一增加资料性附录A;一一原标准方法为第一法皂化提取法;一一补充第二法直接提取法，适用于维生素预混合饲料中维生素A乙酸醋的测定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会CSAC/TC76)提出并归口。本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京)J、北京桑普生物化学技术有限公司、广东爱保农科技有限公司、帝斯曼维生素(上海)有限公司、深圳市蛇口牡丹开发有限公司、广州立达尔生物科技有限公司。本标准主要起草人:赵小阳、施文娟、虞哲高、吴革华、史瑞江、陶正国、陈小兵、李俊玲、李永才、张进、商军。本标准所代替标准的历次版本发布情况
3、为:一-GB/T17817-19990 I 1 范围饲料中维生素A的测定高效液相色谱法GB/T 17817-2010 本标准规定了饲料中维生素A和维生素预混合饲料中维生素A乙酸醋的高效液相色谱法测定。本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A的测定，定量限为1000 IU/峙。本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素A乙酸醋的测定，定量限为344mg/kg(106 IU/kg)。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达
4、成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699. 1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3第一法皂化提取法3. 1 原理碱溶液皂化试样后，用乙酷将维生素A提取出来，蒸除溶剂，残渣溶于适当溶剂，注入高效液相色谱仪分离，在波长326nm条件下测定，外标法计算维生素A含量。3.2 试剂和溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682中一级用水规定，溶液按照
5、GB/T603配制。3.2. 1 元水乙酷(不含过氧化物)3. 2. l. 1 过氧化物检查方法:用5mL乙醒加1mL腆化饵溶液(3.2.9)，振摇1min，如有过氧化物则放出游离腆，水层呈黄色，或加淀粉指示液(3.2. 10) ，水层呈蓝色。该乙酷需处理后使用。3.2.1.2 去除过氧化物的方法:乙酷用硫代硫酸铀溶液(3.2.11)振摇，静置，分取乙酿层，再用水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集悟出的乙酶，再检查过氧化物，应符合规定。3.2.2 元水乙醇。3.2.3 正己炕z色谱纯。3.2.4 异丙醇:色谱纯。3.2.5 甲醇z色谱纯。3.2.6 2，6-二叔丁基对甲酣(BHT)。
6、3.2.7 元水硫酸销。3.2.8 氮气(纯度99.9%)。3.2.9 腆化饵溶液:100 g/L。3.2.10 淀粉指示液:5g/L(临用现配)。G/T 17817-2010 3.2.11 硫代硫酸铀溶液:50 g/L。3.2.12 氢氧化饵溶液:500 g/L。3.2. 13 L-抗坏血酸乙醇溶液:5g/L。取0.5g L-抗坏血酸结晶纯品搭解于4mL温热的水中，用元水乙醇(3.2.2)稀释至100mL，临用前配制。3.2.14 酣歌指示剂:10 g/L。3.2.15 维生素A乙酸醋标准品:维生素A乙酸醋含量二三99.0%。3.2.16 维生素A标准贮备液:称取维生素A乙酸醋标准品(3.2
7、.15)34.4 mg(精确至0.00001 g)于皂化瓶中，按分析步骤(3.的皂化和提取，将乙醒提取液全部浓缩蒸发至干，用正己皖、溶解残渣置入100 mL棕色容量瓶中并稀释至刻度，混匀，4C保存。该贮备液浓度为344g/mLCl000 IU/mL)，临用前用紫外分光光度计标定其准确浓度。3.2.17 维生素A标准工作液:准确吸取1.00 mL维生素A标准贮备液(3.2.1时，用正己烧(3.2.3)稀释100倍;若用反相色谱测定，将1.00 mL维生素A标准贮备液置入100mL棕色容量瓶中，用氮气吹干，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为3.44g/mL(10IU/mL)。3
8、.3 仪器和设备3.3.1 分析天平，感量0.001g。3.3.2 分析天平，感量O.OO 1 g , 3.3.3 分析天平，感量0.00001 gp 3.3.4 圆底烧瓶，带回流冷凝器。3.3.5 恒温水浴或电热套。3.3.6 旋转蒸发器。3.3.7 超纯水器。3.3.8 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。3.4 采样按照GB/T14699. 1的规定执行。3.5 试样制备按照GB/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。3.6 分析步骤3.6.1 试样溶涯的制备3. 6. 1. 1 皂化称取试样配合饲料或浓缩饲
9、料10g，精确至0.001g，维生素预混合饲料或复合预混合饲料195 g，精确至0.0001g，置入250mL圆底烧瓶中，加50mL L-抗坏血酸乙醇溶液(3.2. 13) ，使试样完全分散、浸湿，加10mL氢氧化饵溶液(3.2.12)，混匀。置于沸水浴上回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL无水乙醇(3.2.2)、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40c。3.6. 1. 2 提取定量转移全部皂化液于盛有100mL元水乙醒(3.2. 1)的500mL分液漏斗中，用30mL50 mL 水分2次3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡
10、2min，静置、分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100mL、60mL乙酷重复提取两次，弃去水相，合并三次乙酷相。用水每次100mL洗涤乙酷提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙酷提取液通过元水硫酸铀(3.2.7)脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mg BHT(3. 2. 6)使之溶解，用乙酷定容至刻度(V1)。以上操作均在避光通风柜内进行。2 GB/T 17817-2010 3. 6. 1. 3 浓缩从乙E速提取液(V1)中分取一定体积(V2)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋转蒸发器烧瓶中，在水浴温度约50.C，部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干。
11、残渣用正己烧溶解(反相色谱用甲醇榕解)，并稀释至10mL(V3)使其维生素A最后浓度为每毫升5IU10 IU，离心或通过0.45m过滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。3.6.2 测定3.6.2.1 色谱条件3.6.2. 1. 1 正相色谱色谱柱:硅胶Si60，长125mm，内径4mm，粒度5m(或性能类似的分析柱); 流动相:正己烧十异丙醇(98十2);流速:1. 0 mL/min; 温度:室温;进样量:20L;检测波长:326nm。3.6.2. 1. 2 反相色谱色谱柱:C18型柱，长125mm，内径4.6mm，粒度5m(或性能类似的分析柱)I 流动相:甲醇十水
12、(95+5); 流速:1. 0 mL/min; 温度:室温;进样量:20fl.L; 检测波长:326nm. 3.6.2.2 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素A标准工作液(3.2.17)和试样溶液(3.6.口，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素A标准色谱图参见图A.1.3.6.2.3 结果计算3.6.2.3. 1 试样中维生素A的含量，以质量分数X1计，数值以国际单位每千克CIU/kg)或毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算:X, =1 XV, XV, X1 - 1 .:;1 r-:- X 1 000 1 P2 X ml X V2 X
13、fl 式中:P1一一试样溶液(3.6.1)峰面积值;V1 -提取液的总体积，单位为毫升(mL);V3一一-试样溶液最终体积，单位为毫升(mL); Pl 维生素A标准工作液(3.2.17)浓度，单位为微克每毫升(g/mL); R 维生素A标准工作液(3.2.17)峰面积值;ml一一试样质量，单位为克(g); V2 从提取液(V1)中分取的溶液体积，单位为毫升(mL);. ( 1 ) fl 转换系数，1国际单位(IU)相当于0.344g维生素A乙酸醋，或0.300g视黄醇活性。3.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。3.6.2.4 重复性同一分析者对同一试样同时两次平行
14、测定所得结果的相对偏差见表1.3 GB/T 17817-2010 表1相对偏差维生素A含量/Cmg/kg)相对偏差/%1. 00X1031. 00X104 土20 1. 00 X 104 1. 00 X 105 土151. 00X1051. 00X10 :l: 10 1. 00X10 土54第二法直接提取法4. 1 原理维生素预混料中的维生素A乙酸醋用甲醇溶液提取，试液注入高效液相色谱柱，在326nm处测定，外标法计算维生素A乙酸醋含量。4.2 试剂和溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GBjT6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682中一级用水规定。4.2.1 维生
15、素A乙酸醋标准品:维生素A乙酸醋含量二三99.0%。4.2.2 维生素A乙酸醋标准贮备液:称取维生素A乙酸醋标准品(4.2.1)34.4mg(精确至0.00001 g) , 于100mL棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)溶解并稀释至刻度，混匀，4oc保存。该贮备液浓度为344g/mLO 000 IU/mL) ，临用前用紫外分光光度计标定其准确浓度。4.2.3 维生素A乙酸醋标准工作液:准确吸取维生素A乙酸醋标准贮备液(4.2.2)1.0 mL于100mL 棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为3.44g/mLOOIU/mL)。4.3 仪器和设备4.3.1 超声波水
16、浴。4.3.2 其他同3.3 0 4.4 采样同3.4。4.5 试样制备同3.504.6 分析步骤4.6. 1 试样溶涯的制备称取试样1g，精确至0.0001 g，置于100mL的棕色容量瓶中，加入约80mL的甲醇，瓶塞不要拧紧，于65oc超声波水浴中超声提取30min，冷却至室温，用甲晖稀释至刻度，充分摇匀。如果试样中维生素A乙酸醋的标示量低于107IU/峙，则将溶液过0.45m滤膜，进样测定，否则需将溶液用甲醇进一步稀释，使维生素A乙酸醋的进样浓度与维生素A乙酸醋标准工作液浓度接近。4.6.2 测定4.6.2. 1 色谱条件4 色谱柱:C18型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5m(或
17、性能类似的分析柱); 流动相:甲醇+水(98+2); 流速:1. 0 mL/min; 温度:室温;进样量:20L;检测波长:326nm。GB/T 17817一20104.6.2.2 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素A乙酸醋标准工作液(4.2.3)和试样潜液(4.6.口，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素A乙酸醋标准色谱图参见图A.2。4.6.2.3 结果计算4.6.2.3.1 试样中维生素A乙酸醋的含量，以质量分数X2计，数值以国际单位每千克OU/kg)或毫克每千克(mg/kg)表示，按式(2)计算:nu nu nu 咱EA -z h4-rJ
18、 一v一叫一2 p-PU Z X ( 2 ) 式中zR 试样溶液(4.6.1)峰面积值EV一一试样溶液(4.6.1)的总稀释体积，单位为毫升(mL); 2一一维生素A乙酸醋标准工作液(4.2.3)浓度，单位为微克每毫升(g/mL); P4一维生素A乙酸醋标准工作液(4.2.3)峰面积值;m2 试样质量，单位为克(g); 12一转换系数，1国际单位(IU)相当于O.344g维生素A乙酸醋。4.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。4.6.2.4 重复性同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%。5 GB/T 17817-2010 附录A(资料性附
19、录)维生素A、维生素AZ酸醋标准色谱图mAU 60 40 20 。一20。2 4 6 8 10 mm 图A.1维生素A标准色谱图mAU 200 150 100 50 。2 3 4 5 6 mm 圄A.2维生素AZ酸醋标准色谱圄6 EON-h-hFH益。国华人民共和国家标准饲料中维生素A的测定高效滚相色谱法GB/T 17817-2010 中晤中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销司除印张0.75字数12千字2010年11月第一次印刷开本880X12301/16 2010年11月第一版祷定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-40641 GB/T 17817-2010 打印H期:2010年12月3H F002
