1、ICS 65. 120 B 46 道B中华人民=H工./、和国国家标准GB/T 17818-2010 代替GB/T17818-1999 饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法Determination of vitamin D3 in feeds High-performance liquid chromatography 2010-09-26发布2011-01-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 17818-2010 目。昌本标准代替GB/T17818一1999(饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法。本标准与GB/T17818-1999主
2、要差异如下:增加资料性附录A;原标准方法为第一法皂化提取法;一一补充第二法直接提取法，适用于维生素预混料中维生素D3的测定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会CSAC/TC76)提出并归口。本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京)J、北京桑普生物化学技术有限公司、广东爱保农科技有限公司、帝斯曼维生素(上海)有限公司、拜耳(四川)动物保健有限公司。本标准主要起草人:赵小阳、施文娟、虞哲高、吴革华、李俊玲、李永才、张进、商军、郑秋峰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T 17818-19990 I 1 范围饲
3、料中维生素矶的测定高效液相色谱法本标准规定了饲料中维生素D3的高效液相色谱法测定。G/T 17818-2010 本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素马的测定，定量限为12.5g/kg(500IU/kg)。本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素乌的测定，定量限为125mg/kg(5 X 106 IU/kg)。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不造用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件
4、，其最新版本适用于本标准。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699. 1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3第一法皂化提取法3. 1 原理用碱溶液皂化试样，乙酿提取维生素且，蒸发乙膛，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注人高效液相色谱反相净化柱，收集含维生素肌淋洗液，蒸发至干，溶解于适当溶剂中，注入高效液相色谱分析柱，在264 nm处测定，外标法计算维生素民含量。3.2 试剂和溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682中一级用水规定，溶液
5、按照GB/T603配制。3.2. 1 元水乙酶(不含过氧化物)3.2. 1. 1 过氧化物检查方法:用5mL乙酷加1mL腆化饵溶液(3.2.9)，振摇1min，如有过氧化物则放出游离腆，水层呈黄色，或加淀粉指示液(3.2.10)，水层呈蓝色。该乙酷需处理后使用。3.2. 1. 2 去除过氧化物的方法:乙醒用硫代硫酸铀溶液(3.2.11)振摇，静置，分取乙酷层，再用水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集锢出的乙膛，再检查过氧化物，应符合规定。3.2.2 元水乙醇。3.2.3 正己皖:色谱纯。3.2.4 1，4-二氧六环。3.2.5 甲醇:色谱纯。3.2.6 2，6-二叔丁基对甲酣(BHT
6、)。3.2.7 元水硫酸铀。3.2.8 氮气(纯度99.9%)。3.2.9 腆化饵溶液:100 g/Lo 1 GB/T 17818-2010 3.2. 10 淀粉指示液:5g/L(临用现配)。3.2. 11 硫代硫酸铀溶液:50g/L。3.2.12 氢氧化饵溶液:500g/L。3.2. 13 L-抗坏血酸乙醇溶液:5g/L，取0.5g L-抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的水中，用元水乙醇(3.2.2)稀释至100mL，临用前配制。3.2. 14 酣敢指示剂:10g/L。3.2.15 氯化铀溶液:100g/L。3.2.16 维生素D3标准品:维生素D3含量99.0%。3.2.17 维生素D3标
7、准贮备液:称取50mg维生素D3(胆钙化醇标准品(3.2.16)(精确至0.00001 g) 于50mL棕色容量瓶中，用正己皖溶解并稀释至刻度，混匀，40C保存。该贮备液浓度为1.0mg/mL。3.2.18 维生素D3标准工作液z准确吸取维生素D3标准贮备液(3.2.17)，用正己烧(3.2.3)按1: 100 比例稀释，若用反相色谱测定，将1.0 mL维生素D3标准贮备液置入10mL棕色容量瓶中，用氮气吹干，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，再按比例稀释，该标准工作液浓度为10g/mL。3.3 仪器和设备3.3.1 分析天平，感量0.001g。3.3.2 分析天平，感量。.0001 g。
8、3.3.3 分析天平，感量0.00001 g。3.3.4 圆底烧瓶，带回流冷凝器。3.3.5 恒温水浴或电热套。3.3.6 旋转蒸发器。3.3.7 超纯水器。3.3.8 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。3.4 采样按照GB/T14699. 1的规定执行。3.5 试样制备按照GB/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，说匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。3.6 分析步骤3.6. 1 试样溶液的制备3.6. 1. 1 皂化称取试样，配合饲料10gto g，浓缩饲料10g，精确至0.001g，维生素预混合饲料或复合预混合饲料1g5 g，精确至0.000
9、1 g，置入250mL圆底烧瓶中，加50mL 60 mL L-抗坏血酸乙醇溶液(3. 2. 13) ，使试样完全分散、浸湿，加10mL氢氧化伺溶液(3.2.12)，混合均句，置于沸水浴上回流30 min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL无水乙醇(3.2.2)、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40.C。3.6. 1. 2 提取定量转移全部皂化液于盛有100mL无水乙酿(3.2. 1)的500mL分液漏斗中，用30mL50 mL 水分2次3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡2min，静置分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100mL、
10、60mL乙酷重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醒相。用氧化铀溶液(3.2.15)100mL洗涤一次，再用水每次100mL洗涤乙酷提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙酿提取液通过元水硫酸铀(3.2. 7)脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mg BHT(3. 2. 6)使之溶解，用乙酷定容至刻度(Vj)。以上操作均在避光通风柜内进行。2 GB/T 17818-2010 3.6.1.3 浓缩从乙酷提取液(Vj)中分取一定体积(V2)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度50.C的条件下蒸发至干，或用氮气吹干。残渣用正己烧(3.2.
11、3)溶解(需净化时用甲醇溶解，按3.6.1.4进行)，并稀释至10mL(民使其获得的溶液中每毫升含维生素D32罔10g(80IU400 IU)，离心或通过0.45m过滤膜过滤，收集清液移人2mL小试管，用于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。3.6.1.4 高效液相色谱净化柱净化用5mL甲醇(3.2.5)溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱中注射0.5mL甲醇溶液(按3.6.2.1所述色谱条件，以维生素D3标准甲醇溶液流出时间士0.5min)收集含维生素D3的情分于50 mL小容量瓶中，蒸发至干或用氮气吹干)，需解于正己烧中。所测样品的维生素Dll标示量在每千克超过1000
12、0 IU范围时，可以不使用高效液相色谱净化柱，直接用分析柱分析。3.6.2 测定3.6.2.1 高效渣相色谱净化条件色谱净化柱:Lichro$orb RP-8，长25cm，内径10mm，粒度10m。流动相:甲醇十水(90十10)。流速:2.0mL/min。温度:室温。检测波长:264nm。3.6.2.2 高效液相色谱分析条件3.6.2.2. 1 正相色谱色谱柱:硅股Si60，长125mm，内径4.6mm，粒度5m(或性能类似的分析柱。流动相:正己;皖+1，4二氧六环(93+7)。流速:1.0mL/min 温度=室温。进样量:20L。检测波长:264nmo 3.6.2.2.2 反相色谱色谱柱:C
13、18型柱，长125mm，内径4.6mm，粒度5m(或性能类似的分析柱)。流动相:甲醇+水(95十日。流速:1. 0 mL/min. 温度:室温。进样量:20L。检测波长:264nm. 3.6.2.3 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，为准确测量按要求对分析柱进行系统适应性试验，使维生素D3与维生素D3原或其他峰之间有较好分离度，其R二三1.5。向色谱柱注入相应的维生素D3标准工作液(3.2.18)和试样溶液(3.6. 1) ，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。3.6.2.4 结果计算3.6.2.4. 1 试样中维生素D3的含量，以质量分数X1计，数值以国际单位每千克CIU/
14、kg)或毫克每千克(mg/kg)表示，按式。)计算:pj XV1 XV3 Xj X 1. 25 sy r - X 1 000 ( 1 ) P2 X mj X V2 X 11 3 GB/T 17818-2010 式中zP1一试样溶液(3.6. 1)峰面积值;V1一一提取液的总体积，单位为毫升(mL);V3一一试样溶液最终体积，单位为毫升(mL); P1一一维生素D3标准工作液(3.2.18)浓度，单位为微克每毫升(g/mL); P2一一一维生素D3标准工作液(3.2.18)峰面积值pm 试样质量，单位为克(g); V2一一从提取液(V1)中分取的溶液体积，单位为毫升(mL); 11一一转换系数，
15、1国际单位(IU)维生素D3相当于0.025阅胆钙化醇。注:维生素且对照品与试样同样皂化处理后，所得标准溶液注入高效液相色谱分析柱以维生素D3峰面积计算时可不乘1.25。3.6.2.4.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。3.6.2.5 重复性同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。表1相对偏差维生素D3含量/CIU/kg)相对偏差/%1. 00 X 103 1. OOX 105 士20 1. 00 X 105 1. 00 X 10 士151. 00X10 土104第二法直接提取法4. 1 原理维生素预混合饲料中的维生素D3用甲醇溶液提取，试液注入高效液相
16、色谱柱，在264nm处测定，外标法计算维生素D3含量。4.2 试剂和溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682中一级用水规定。4.2.1 维生素D3标准品:维生素D3含量二三99.0%。4.2.2 维生素D3标准贮备液z称取维生素D3标准品(4.2.1)100mg(精确至0.00001 g)，于100mL 棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)溶解并稀释至刻度，混匀，4.C保存。该贮备液浓度为1.0 mg/mL. 4.2.3 维生素D3标准工作液:准确吸取维生素D3标准贮备液(4.2.2)1.0 mL于100mL棕色容量瓶中，用
17、甲醇(3.2. 5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为10g/mL。4.3 仪器和设备4.3.1 超声波水浴。4.3.2 其他同3.304.4 采样同3.4。4.5 试样制备同3.504.6 分析步骤4.6.1 试样溶液的制备称取试样1g，精确至O.OOOlg，置于100mL的棕色容量瓶中，加入约80mL的甲醇，瓶塞不要拧4 GB/T 17818-2010 紧，于65.C超声波水浴中超声提取30min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，将溶液过0.45m滤膜，进样测定，使待测样品维生素队的进样浓度与标准溶液浓度接近。4.6.2 测定4.6.2.1 色谱条件色谱柱:C18型柱，长150mm
18、，内径4.6mm，粒度5m(或性能类似的分析柱)。流动相:甲醇+水(98+2)。流速:1.0 mL/min。温度:室温。进样量:20L。检测波长:264nm. 4.6.2.2 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素D3标准工作液(4.2.3)和试样溶液(4.6.1)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。维生素D3标准色谱图参见图A.1。4.6.2.3 结果计算4.6.2.3. 1 试样中维生素D3的含量，以质量分数X2计，数值以国际单位每千克CIU/kg)或毫克每千克(mg/kg)表示，按式(2)计算:X. =_E立xvx?2-。气X1. 07 X 1 0
19、00 P4 X m2 X f2 ( 2 ) 式中zR 试样溶液(4.6.1)峰面积值;V 试样溶液(4.6.1)的总稀释体积，单位为毫升(mL); P2 维生素D3标准工作液(4.2.3)浓度，单位为微克每毫升(g/mL); P4-维生素D3标准工作液(4.2.3)峰面积值;m2一一试样质量，单位为克(g); 12一一转换系数，1国际单位(lU)维生素D3相当于0.025g胆钙化醇51. 07一-提取时生成预维生素队的校正因子。注:维生索马标准品与试样同样处理后，所得标准溶液注入高效液相色谱分析柱以维生素D3峰面积计#时可不乘1.07. 4.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三
20、位有效数字。4.6.2.4 重复性同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%。5 GB/T 17818-2010 附录(资料性附录)维生素D3标准色谱图A 由F.hhmAU 14 12 10 8 6 4 2 。口IIn18 16 14 12 10 8 6 4 2 。维生素D3标准色谱图图A.16 EON-FhFH因。国华人民共和国家标准饲料中维生素矶的测定高效液相色谱法GB/T 17818-2010 中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张O.75 字数12千字2010年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2010年11月第一版晤定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-40642 GB/T 17818-2010 打印H期:2010年12月9日F002A
