1、G8/T 17819-1999 前维生素预f昆料中维生素Bl2测定方法尚无国际标准。本标准参考色i苦科学杂志第lS卷和法国罗纳普朗克动物营养公司提出的分析方法，该法简捷、快速、准确.在技术内容立采用其中技术条仲，在编写规格上，依据GB/T). )-1993(标准化工作导则第1单元z标准的起草与表述规则第iI部分标准编写的基本规定和GB/T). 4-1988(标准化工作导则化学分析方法标准编写规定儿本标准的附录A是标准的附录。本标准由全国饲料工业标准化委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人:李兰、陈必芳、梁冬生。二7(i1 范围中华人民共和国国家标准
2、维生素预混料中维生素B2的测定高效液相色谱法Determination of vitamin B12 in vitamins premix High-pressure Iiquid chromatography GBiT 17819 1999 本标准规定了用高效液相色谱法测定维生素预混料中维生素Bl2的方法。本标准适用于维生素预混料、维生素B预混制剂中维生素B12的测定。检测范围为每千克佯品中维生素B12含量大于0.25mgo 2 方法原理试样中维生素Bl2用水提取，经高效液相色谱反相柱分离，其峰面积与维生素Bl2的含量成正比。3 试剂和材料本标准所用试剂除特殊注明外.均为优级纯，水为去离子水
3、。3. 1 乙睛:色谱纯。3- 2 JE磷酸溶液。3- 3 25%乙醇溶液。3.4 维生素Bl2标准溶液。3. 4. 1 维生素B12标准贮备溶液=准确称取O.100 0 g维生素B12纯品(符合USP).溶解于1mL乙醇溶液(3.)巾，并稀稀定容至刻度，摇匀。该标准贮备液每毫升含维生素BI21mgo 3. 4. 2 维生素B矶12标准工作液2准确吸取维生素B动相草珩稀#暗I释定容刻度，摇匀1。该标准工作液1mL含维生素B122悔。4 仪器、设备4. 1 实验室常用设备。4.2 超声波水浴。4.3 高效液相色谱仪，带自动进样器，紫外可i周波长检测器。4.4 届纯水装置。4.5 离心机，3000
4、r/mino 5 试样审l备取具有代表性样品罕少500g.用四分法缩分至100g.粉碎.全部过。.28mm孔筛，混匀，装入样品瓶内密闭.避光低温保存备用。国家质量技术监督局199908-10批准2002 -01实施, .GB/T 17819-1999 6 分析步骤6. 1 提取6. 1. 1 维生素预)!i料中维生素B的提取称取试样23g(精确至士0.0001 g).置于100mL棕色容量瓶中，加约60mL去离子水，在超声波水?在中超声提取15mln，取出，用去离子水定容至当时度，混匀，过滤，滤液过0.45m滤膜，供高效液相色谱仪分析。6.1.2 维生素B制齐1(1 %2%)的提取称取试样1g
5、(精确至土0.0001 g)于100mL棕色容量瓶中，加入约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取10min，取出用去离子水定容过滤。精确吸取1.00 mL溶液于50mL棕色容量瓶中.用去离子水定容至刻度，该液通过0.45m滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。6.2 测定步骤6.2.1 色谱条件柱子:I-BondpakNH，.粒度5m.3.9mmX 300 mm。柱温:30C。流动相:3%正磷酸水溶液260mL与700mL乙腊混合，超声脱气。流速:1. 7 mL/min. 检测波长:361nm。6.2.2 定量测定按离效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，用两次以上相应标准工作液，对系统进行校正。
6、将通过0.45m滤膜的样液(6.1.1)依次分装于自动进样小瓶中，依外标法上液相色谱仪测定。6.2.3 也可采用反相离子对高效液相色谱测定维生素B12的方法(见附录A)7 测定结果的计算测定结果按式。)计算: v-t x-v an-x 一mv-x x-PU P-问., ( 1 ) 式中且-每千克样品中维生素Bll的含量，mg;m一试祥质量，g;V，一-试样溶液进样体积，L;P, 试样溶液峰面积值;V一-试样稀释的体积，mL;p，一标准溶液浓度，g/mL.V一一标准溶液进样体积，L;瓦一标准溶液峰面积平均值。每个试祥取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。结果表示到每千克样品中维生素B
7、1,O. 01 mg. B 允许差同4分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差应不大于15%。:7刊A1 原理GB/T 17819 1999 附录A(标准的附录)反相离子对高效液相色i曹jl定:预混料中维生素B试样中维生素B经水提取后，注入反相色谱柱上，由于输入了有机的反相离子对四丁基磷酸镀(PIC AJ和己烧磺酸销(PIC-B，)溶液，维生素B12的阳离子与移动相中阴离子形成离子偶化合物，在移动过程中与固定相分开达到分离.A2 试剂和材料A2.1 甲醇优级纯)。A2.2 磷酸。A2.3 四丁基磷酸钱。ICA)。A2.4 己烧磺酸销(PIC-B6)。A3 测定色i曾条件柱子:150mmX4. 0 mm(内径)不锈钢柱。固定相:1-Bondpak C以ODS)粒度5m.移动相:甲醇-水(250十750)约980mL.加入PICA、PICB，(各一小瓶)20mL，用上述25%甲醇水定容至1L.混匀，用磷酸调节pH3.流速:1 mL/min。柱温.室温。检测器:紫外检测器，使用波长365nm. 进样量:20L.保留时间:约7.0mino A4 其他各项与正文相同
