1、G8/T 18649-2002 前言牛肺疫是由丝状支!原体丝状亚种CPG1)引起的一种牛属动物的传染病。健康牛和病牛接触由呼吸道吸入病牛的飞沫，是本病的主要传染方式和感染途径。暴发流行时多呈急性病演，呼吸系统症状非常明显，体温在41C以t稽留。但在病的常在地区多见亚急性和慢性病程，以地方流行性为特点。急性期病变为浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎，肺间质多孔多汁，肺小叶出现各期肝变、多色，呈大理石样肺，肺胸膜和肋胸膜粘连.以及胸腔渗出液大量满留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。慢性病牛t主期带菌，成为隐蔽的传染源。在新发的地区对此病的检验应采取流行病学、临床学、血清学、病理学和病原学综合诊断方
2、法为宜。世界动物卫生组织WorldOrganization for Animal HealthC英),Office Intentional des Epizootic C法), 。IE于1986年和1992年推荐采用稍加改进的Campbell和Turner的补体结合试验作为牛肺疫血清学诊断的方法，但常出现非特异性反应。新中国成立后一直采用补体结合试验检验牛肺疫，并于1979年将该法列入农业部颁布的动物检疫操作规程中，但这种方法常出现1%2%非特异性反应。近年来我国研制成功了特异性高的微量凝集反应检验方法，它不但降低了非特异性反应率，而且操作简便，容易判定，应用效果良好。病原学诊断主要取病牛肺脏
3、，胸腔渗出液和肺门淋巴结接种马丁培养基，即可分离出牛肺疫病原体，此法对急性期病例的检出率可达100%。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人g白文彬。207 中华人民共和国国家标准牛传染性胸膜肺炎(牛肺擅)诊断技术GB/T 18649-2002 Diagnostic techniques for contagious bovine pleuropneumonia 1 范围本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、补体结合试验、微量凝集
4、试验诊断技术要求。本标准适用于牛传染性胸膜肺炎的检验。病原学检查适用于急性、亚急性及慢性病牛分离病原体，补体结合试验和微量凝集试验适用于牛肺疫抗体的检测。2 病原学被查2. 1 材料准备培养基:10%马血清马I肉汤，10%马血清马丁琼脂L见附录A(标准的附录门。2.2 病料采集2. 2. 1 用灭菌器械(剪刀、银子、吸管、青霉素瓶等)无菌采集肺脏、胸腔渗出液、肺门淋巴结，并将肺病料剪成3cm-5 cm方块。胸部淋巴结，以整个淋巴结为好，胸腔渗出液用吸管吸入青霉素瓶内。2.2.2 受检病料的保存:肺和淋巴结保存在用茶色广口瓶盛装的灭菌的40%-50%甘油生理盐水中，胸腔渗出液不加任何保存液。病料
5、均放入冰箱内保存，并应尽快送往实验室检验。2.3 培养方法在无菌条件下剪肺病料或淋巴结小块，用铅金耳钓人10%马血清马丁肉汤内P胸腔渗出液用灭菌吸管吸取0.1mL-O. 3 mL接种于马丁肉汤中即可。同时取剪碎病料小块或直接取胸腔渗出液，用铀金耳在10%马血清马丁琼脂培养皿上划线接种，培养皿用胶布封口，置3TC-38C培养，每天观察一次，5 d-7 d后判定。2.4 结果判定2. 4. 1 培养特征2.4.1.1 培养性状和菌落形态g牛肺疫病原微生物在10%马血清马丁肉汤内生长初期是轻微混浊或呈白色点状、丝状生长，以后逐渐均匀混浊，半透明稍带乳光，不产生菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在10%马血清
6、马丁琼脂培养皿上生长迟缓，为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落，中央有乳头状突起。菌落直径约0.2mm-O. 5 mm，小的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。2.4.1.2 染色镜检取马丁肉汤培养物涂片放温箱中干燥，后在酒精灯上轻微火焰固定，再用3%-5%锚酸蒸馆水溶液固定1min - 2 min，水洗，浸入用蒸馆水稀释的1: 30的姬姆萨氏染液中染色，染片时染色缸放人普通冰箱内过夜，染色后取出用蒸馆水轻洗，自然干燥后用800-1000倍显微镜观察。菌形为多形态，以球点形最常见，大小在125nm-250 nm。2.4.2 生化特性2.4.2.1 糖发酵试验2.4.2.1.1 取蛋臼陈水(p
7、H7.8-8. 0)100 mL，氯化销0.5g所需各种糖类0.5g-1. 0 go溶解各成分，加入1.6%澳甲盼紫酒精溶液指示剂。.1mL混匀，分装三分管内装2mL，管内装有倒置的小玻璃申华人民共和国国东质量监督检验检瘦总局2002- 02 -19批准2002-0电01实施20H GB/T 18649-2002 管(杜汉氏发酵管。经106.4 kPa 20 min灭菌。2.4. 2. 1.2 在进行糖发酵试验时，首先将各种糖培养基小管加无菌的马血清0.2mL.再加受检的菌液0.1 mL置37.C38.C下培养5d7 d。2.4. 2. 1. 3 结果判定z牛肺疫菌可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊
8、精、淀粉产酸使培养基变黄，而不产气g不能分解果糖、萧糖、草糖、单奶糖和杨背。2.4.2.2 硫化氢(H，S)试验2.4. 2. 2. 1 乙酸铅纸条的制备z取滤纸剪成6.5 cm X o. 6 cm大小的纸条，置平皿中，经112kPa 20 min灭菌，烘干，再将滤纸条浸泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液(10g乙酸铅溶于50mL沸蒸馆水中，即为饱和乙酸铅溶液).浸透后取出，置无菌平皿内.3TC烘干，保存于灭菌的试管中。2.4.2.2.2 试验方法:受试菌接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上，取一片乙酸铅滤纸条，夹在试管的棉塞下悬挂，置3TC培养5d7 d.滤纸条变黑或棕褐色者为阳性反应。2.4.2.
9、 3 硝酸盐还原试验2.4. 2. 3. 1 培养基的准备:取营养肉汤或马丁肉汤100mL.硝酸御(KN，)0.1g.调pH至7.88. O. 分装试验管.112kPa 20 min灭菌。2.4. 2.3.2 试剂的准备试剂1.甲液2对氨基苯磺酸。.5 g. 5血。I/L乙酸100mL.乙液:a.荼胶0.5g , 5 mol/L乙酸100 mL。试剂2.二苯胶试弗IJ，二苯胶0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馆水稀释。2.4. 2. 3. 3 试验方法。首先向硝酸盐培养液中加10%元菌马血清，然后将试验菌接种于硝酸盐培养基中，同时设不接种的对照管，于3TC培养5d7d。于5d和7d时
10、取培养液少许放人干净的小试管中，再各滴一滴试剂甲液和乙液，对照管同样加试剂。若试管菌液呈现红色，橙色者为阳性反应，直日元红色出现，则可加一二滴二苯胶试剂，若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在s如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质，贝u仍按硝酸盐还原试验阳性反应。2.4.2.4 能基质试验2.4.2.4.1 培养基准备z蛋白陈1g.氯化销O.5匾，色氨酸。.1 g.蒸馆水100mLo榕解各成分，调pH至7.88.0分装试管，经106.4 kPa 20 min灭菌。2.4.2.4.2 试押IJ，对二甲基氨基苯甲醒5g.95%乙醇75mL.浓盐酸25mL。对二甲基氨基苯
11、甲醒溶于乙蹲中，再缓缓加人浓盐酸即成。2.4. 2. 4. 3 试验方法s先向培养基中加入10%元菌马血清，再将试验菌接种于培养基中.37c培养5d7d后，滴加试剂数滴于培养物液菌，轻轻摇动，红色为阳性反应。黄色为阴性反应。2.4.2.5 甲基红(MR)试验2.4.2.5.1 培养基E蛋白陈0.7g.葡萄糖0.5g.磷酸氢二梆0.5g.蒸馆水100mL。各成分浴解后，调pH7. 88. O.分装试管。经106.4kPa 20 min灭菌备用。2.4.2.5.2 试剂z甲基红0.02g.95%酒精60mL.蒸馆水40mLo先将甲基红研磨溶解于酒精中，再加蒸馆水即成。2.4. 2.5.3 试验方法
12、:按10%量向培养基中加无菌马血消，再接种试验菌.37C培养5d7 d。于第五天时取少许培养液子另一支试管中，并加几滴试剂，如培养液呈现红色为MR试验阳性s黄色者为阴性，继续培养至第7天，再进行试验。2.4.2.6 维培二氏(VP)试验2.4. 2. 6. 1 培养基与MR试验相同。2.4.2.6.2 试剂与方法g可用下列三种试剂进行VP试验:a) Barritts试剂法，甲液:6%荼盼酒精溶液。乙液:40%氢氧化饵溶液。取MR试验的同一培养物约2mL.加甲液1mL.乙液0.4mL.充分混合，在5mio内呈粉红色反应为阳性。209 GB/T 18649-2002 b) OMearas试ll1J
13、法:氢氧化惆(或氢氧化销)40g，肌曹f(creatine)0.3g，蒸馆水100mL取上述同一培养物约2mL加等量试剂相混合，充分振荡试管，在5min内呈粉红色者为阳性反应。c)硫酸铜试ll1J法，硫酸铜1日，浓氨水40mL，10%氢氧化何960mL.硫酸铜溶化于40mL浓氨水中，加10%氢氧化饵960mL即成。试验时加等量的试剂于培养物中混合，在5min内呈粉红色反应为阳性。上述三种方法为阴性，继续培养，再行观察。3 补体结合试验3- 1 材料准备3. 1. 1 稀释液2系用常规方法配制0.85%生理盐水。3. 1.2 2.5%绵羊红细胞悬液2无菌采集绵羊血，脱纤经两层纱布过滤后，用生理盐
14、水洗涤3次，每次2 000 r/min离心，10min，最后用生理盐水将红细胞泥配成2.5%悬液。3. 1. 3 抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素，按说明书使用。抗原效价滴定方法见附录B(标准的附录)。溶血素效价滴定见附录C(标准的附录)。3. 1. 4 补体效价滴定方法见附录D(标准的附录)。3. 1. 5 标准溶血管的制备.见附录E(标准的附录)。3. 2 操作方法3.2.1 被检血清、标准阴、阳性血清均用灭菌生理盐水作1, 5稀释于60C水浴锅中灭活30min. 3.2.2每份被检血清用两支康氏管或三分管(Omm X 100 mm).每管加入1 5稀释的灭活血清0.25. mL。3-
15、 2. 3 其中一管加工作量抗原0.25mL，另管加生理盐水0.25mL。3- 2. 4 每管加入工作量补体0.25mL 3- 2. 5 摇匀，放37C 38C水浴20min. 3- 2. 6 每管加入二单位溶血素。.25mL。3- 2. 7 每管加入2.5%红细胞悬液0.25mL. 3- 2. 8摇匀，37C38C水浴20min. , 3.2.9 设标准阳性血清、阴性血清、补体对照(包括抗原、盐水)以及红细胞对照。主试验操作程序、各要素加入量见表1。表1主试验操作程序样品对照管号l 2 3 4 5 6 7 8 被检血清阳性血清阴性血清补体对照血清O. 25 0.25 O. 25 0.25 0
16、.25 0.25 F作量抗原0.25 0.25 0.25 0.25 工作量补体O. 25 0.25 0.25 O. 25 O. 25 0.25 0.25 0.25 生理盐水0.25 0.25 o. 25 0.25 O. 5 振荡后37C3BC水百20 min 单位溶血章0.25 0.25 0.25 0.25 O. 25 。.25 。自25O. 25 2.5%红细胞O. 25 O. 25 0.25 0.25 0.25 O. 25 0.25 0.25 振荡后37C38C本浴15min 结果m色判定11，对照38管及红细胞管每次试验只作一组a210 mL 红细胞对照0.75 0.25 0.25 GB
17、/T 18649-2002 3. 3 判定标准3. 3. 1 fJJ判和终判3- 3.1.1 初判:试验完毕后取出立即进行第一次判定。对照管中阳性血清加抗原应完全抑制溶血十+十十，其他对照管完全溶血，证明试验操作中元误。被检血清对照管发生不完全溶血或完全抑制溶血时，此份血清应复试。若本试验管完全溶血则判为阴性。如不完全溶血或完全抑制溶血时放室温冷暗处静置12h进行第二次判定。3.3.1.2 终判=将被检血清管与溶血度标准比色管比较上清液色调和红细胞沉积量，以决定溶血程度而作最终判定。3. 3. 2 浴血程度的判定标准血清1 5稀释榕血程度的050%溶血判为阳性e血清1, 5稀释溶血程度的60%
18、80%溶血判为可疑g血清1 5稀释溶血程度的90%100%溶血判为阴性;可疑者重检，若仍为可疑可判为阳性。4 微量提集试验4. 1 材料准备4. 1. 1 稀释液，系用常规方法配制的0.85%生理盐水。4.1.2 抗原、标准阳性血清、阴性血清按说明书使用。4. 1. 3 DYE型25L加样器，酶标反应板或微量滴定板(微量板儿4.2 操作方法4.2.1 被检血清、标准阳性血清、阴性血清用灭菌生理盐水作1 4或1 5稀释，经56C58C灭能30 min。4.2.2 抗原用灭菌生理盐水稀释成工作量(1, 8)。4.2.3 用微量加样器吸取被检血清25L，加人微量板的一个孔中。4.2.4 加工作量抗原
19、25L于同一孔内，即每头份被检血清用一个孔。4.2.5 每板设阴、阳性血清和生理盐水对照。4.2.6 轻轻摇动反应板混匀，放室温暗处或4C8C冰箱内5h-20 h左右。4.3 判定4. 3- 1 判定标准4.3.1.1 凝集程度:十十+十为100%凝集;+为75%凝集;十+为50%凝集;+为25%凝集;一为不凝集。4.3.1.2 判定方法:判定前轻轻振动反应板，静置3min_ 5 min即行判定。判定时用8W日光灯照明，手持反应板，借助侧光在黑色背景上判定或用凝集反应箱观察。受检血清出现阳性反应的需重复试验一次，如两次结果不一致时，应再复试一次，以两次以上试验结果一致时为准。4. 3. 2 在
20、阴、阳性血清和生理盐水对照正确的情况下，被检血清出现十+以上凝集的判为阳性;+和.，为阴性反应。211 GB/T 18649-2002 附录A(标准的附录)培养基A1 10%马血清马丁肉汤(pH7.88. 0)将和l备的马丁肉汤分装于灭菌试管内，每管4.5mL.添加元菌马血清0.5mL。A2 10%马血清马丁琼脂z马丁肉汤中加入琼脂，使含量达.3%1. 5%.经121kPa高压灭菌30min 即成马丁琼脂。在灭菌的6cm - 8 cm直径培养皿内加元菌马血清1mL.再添加煮沸融化降温至55C60 C的马丁琼脂9mL，轻轻摇动混合均匀，静置凝固后即成马丁琼脂培养基。附录B(标准的附录)抗原效价测
21、定按兽医生物药品厂判定的效价，在每批初次使用时重新测定，以后可每三个月测定一次。牛肺疫标准阳性血清按表Bl稀释，阴性血清作1; 5稀释后，置56.C58.C灭活30min. 表Bl阳性血清稀释管号l 2 3 4 5 稀释倍数5 10 20 40 60 血清量/mL1 2 2 2 2 生理盐水/mL4 2 2 2 1 抗原先根据原测定的效价稀释为工作抗原，再按表B2稀释。表B2抗原稀释管号1 2 3 4 5 稀释100% 80% 60% 40% 20% 工作抗原/mL5 4 3 2 1 稀释液/mL。l 2 3 4 然后按表B3程序加入试验成分进行抗原效价的测定。表B3抗原效价测定mL 抗原稀释
22、抗原对照成分100% 100% 80% 60% 40% 20% 10% 口:5阳性血清o. 25 o. 25 0.25 0.25 0.25 o. 25 0.25 1 ; 10阳性血清o. 25 o. 25 o. 25 0.25 o. 25 0.25 1 ; 20阳性血清o. 25 o. 25 o. 25 o. 25 o. 25 0.25 1 ; 10阳性血清o. 25 o. 25 o. 25 o. 25 0.25 0.25 1 ; 60阳性血清0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 o. 25 1 ; 5阴性血清0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 o. 25 工作量补体
23、0.25 o. 25 o. 25 0.25 o. 25 0.25 o. 25 生理盐卓0.25 振荡后37C-38C水浴20min 工单位溶血章0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 o. 25 2.5%虹细胞0.25 O. 25 O. 25 O. 25 0.25 o. 25 D. 25 212 GB/T 18649-2002 表B3(完)mL 抗原稀释抗原对照成分100% 80% 60% 40% 20% 10% 100% 振荡后37C38C水浴20min 1 5阳性血清+十+十十十+十十+ 1 10阳性血清十卡十十卡十+十十+ 结1 I 20阳性血清+斗十+十十1 40阳
24、性血清+十+十十十果1 60阳性血清+十+ + 1 5阴性血清抗原效价判定:如表B3所示，抗原效价系指抗原80%稀释液在标准阳性血清1 10的稀释液中，能产生完全抑制溶血现象+J，并在1 40的稀释液中产生50%以上抑制溶血现象(+J者，此效价抗原即为工作量抗原。在阴性血清和不加血清的抗原对照管中均应完全溶血，如抗原对照管发现有抑制溶血现象时，则认为该批抗原有抗补体作用，不能使用。如试验结果发现抗原效价不足时，可继续试验其他浓度较高的抗原稀释液，如原判定效价为1 13 稀释，经测定效价不足，可以提高浓度为1 12、1 11、1: 10.，再按上述方法测定。附录C(标准的附录)溶血素效价的1商定
25、取0.2mL溶血素(含等量甘汹)加9.8mL生理盐水混合成100倍基础液，其稀释方法见表CL表Cl溶血素稀释法mL 试管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 稀释度1 I 500 11000 1 1 500 12000 1 I 2 500 13000 1 , 3 500 114000 1 I 4 500 1 5 000 1 100溶血章O. 1 o. 1 O. 1 o. 1 o. 1 o. 1 O. 1 o. 1 O. 1 O. 1 生理盐水o. 4 0.9 1. 4 1. 9 2. 4 2. 9 3.4 3.7 4.4 4. 9 总量o. 5 1. 0 1. 5 2.0 2. 5 3.
26、 0 3. 5 4.0 4. 5 5. 0 按照表C2顺序加入各种试验成分，在3TC38C水浴15mino能使0.25mL的红细胞液完全溶血的溶血素最小量(最大稀释度)称为一单位。如表C2举例栏中第6管完全溶血，而对照管都没有溶血现象，则该批溶血素的效价即为1 3 000 , 使用两单位溶血素则为1 1 500。表C2溶血素效价测定mL 试管号l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 溶血章1 500 11000 1 1 500 12000 12500 稀释度13000 13500 14000 14500 1:5000 1 100 溶血章用量0.25 o. 25 o. 25
27、0.25 o. 25 O. 25 0.25 o. 25 0.25 O. 25 0.25 1 , 20补体0.25 O. 25 0.25 O. 25 o. 25 0.25 O. 25 0.25 O. 25 0.25 O. 25 。5%红细胞O. 25 0.25 O. 25 O. 25 0.25 0.25 O. 25 0.25 o. 25 0.25 0.25 O. 25 。.25 生理盐水0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 。.50 0.50 0.50 0.50 0.50 o. 75 0.75 1. 0 振荡后37C38C水浴15min 结果判定+ + 十十十+ 十注:. + 抑制溶
28、血，. I 部分榕血，全部溶血。213 补体用生理盐水作10倍稀释。G/T 18649-2002 附录D(标准的附录)补体效价测定阴性血清、阳性血清，作1: 5稀释，56CC58C灭活30min。测定时放四列试管，两列阴性血清(一列加抗原、一列不加抗原，以生理盐水补足其量、两列阳性血清(一列加抗原、一列不如抗原，以生理盐水补足其量)，以阳性血清加抗原为例.按表Dl操作。表01补体效价测定mL 管号成分l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10X补体0.05 0.06 0.07 0.08 O. 09 O. 10 0.11 O. 12 O. 13 0.25 生理盐串0.20 0.1
29、9 。守180.17 O. 16 O. 15 O. 14 O. 13 O. 12 0.75 O. 75 1. 00 抗原(工作量)O. 25 O. 25 O. 25 0.25 O. 25 O. 25 O. 25 O. 25 0.25 5X阳性血清O. 25 。25O. 25 0.25 0.25 0.25 O. 25 O. 25 0.25 5X阴性血清振荡均匀后置3TC-38C串浴中20min 二个单位溶血章0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 O. 25 O. 25 0.25 O. 25 O. 25 2.5%红细胞量液o. 25 O. 25 O. 25 0.25 O. 25 0.2
30、5 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 振荡均匀后置37，(;-38C水浴中20mn 阳性血清加抗原十+ 十+ + 十一卡土十十阳性血清未bu抗原十士土士士结果阴性血清加抗原十土土土土阴性血清未加抗原十 士士在两单位溶血素存在的情况下，可使阳性血清加抗原的试管中完全不溶血，而在阳性血清未加抗原的试管及阴性血清无论有无抗原的试管中发生完全溶血，所需最小补体量，就是补体工作量。如表Dl中的第6管，10倍稀释的补体0.10mL即为工作量，按式(01)计算原补体，在使用时应稀释的倍数:-补体稀释倍数原补体应稀释倍数=TI二击若去去坐使用时每管加入量. . . . .( 01 )
31、 10 上列公式计算=一一XO.25=250.10 即此批补体应作25倍稀释每管加0.25mL即为工作量补体或个补体单位，因补体性质极不稳定在操作过程中效价会降低。故使用时稀稀的浓度比原效价高10%左右，因此本批补体应作1: 22倍稀释，每管加0.25mL。214 GB/T 18649-2002 附录E(标准的附录)标准溶血管的制备为了正确判定溶血程度，可以利用试验中完全浴血的溶液混合，作为溶血溶液。按表El配制。表El溶血度标准比色管配制法及比较判定结果标准mL 试管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 溶血榕液O. 125 0.25 0.375 O. 5 0.625 0.75 O. 875 1. 0 1. 125 1. 25 2.5%红细胞0.25 0.225 0.20 O. 175 o. 15 O. 125 0.10 0.075 0.05 0.025 生理盐7)(1. 0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 溶血/%。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 判定符号+十+十+ + 十+十十+ + 判定标准阳性疑似阴性215
