1、ICS 65.150 B 50 GB 中华人民共和国国家标准G/ T 18654. 12- 2002 养殖鱼类种质检验第12部分:染色体组型分析Inspection of germplasm for cultured fishes Part 12: Method for the karyotype analysis 2002 - 02 -19发布2002 - 05 -01实施 中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前去一口GB/ T 18654(养殖鱼类种质检验分为下列部分:一一第1部分:检验规则;一第2部分:抽样方法;一一第3部分:性状测定;一一第4部分:年龄与生长的测定;一一第5部分:
2、食性分析;一一第6部分:繁殖性能的测定;一一第7部分:生态特性分析;一一第8部分:耗氧率与临界窒息点的测定;一一第9部分:含肉率测定;一一第10部分:肌肉营养成分的测定;一一第11部分:肌肉中主要氨基酸含量的测定;一-第12部分:染色体组型分析;一一第13部分=同工酶电泳分析;一一第14部分:DNA含量的测定;一一第15部分:RAPD分析;本部分为GB!T18654的第12部分。本部分的附录A、附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由中国水产科学研究院长江水产研究所归口。本部分起草单位:中国水产科学研究院长江水产研究所、上海水产大学。本部分主要起草人:曾勇、徐忠法、李思发
3、、周瑞琼、何力。GB! T 18654. 12- 2002 GB/ T 18654.12-2002 养殖鱼类种质检验第12部分:染色体组型分析1 范围GB/ T 18654的本部分规定了鱼类染色体组型分析的试剂和材料、仪器和设备、玻片标本的制备和组型分析。本部分适用于鱼类染色体组型分析，对于水产养殖中的其他水生动物亦可参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18654的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最
4、新版本适用于本部分。GB/ T 18654.2 养殖鱼类种质检验第2部分:抽样方法3 术语和定义下列术语和定义适用于GB/T18654的本部分。3. 1 体细胞体外培养法somatic cell culture in vitro 通过无菌操作，获取鱼的肾脏组织或血细胞，在体外培养过程中，加入细胞分裂剌激物，剌激淋巴细胞大量进入分裂状态。然后，加入适当浓度的秋水仙素，使细胞分裂被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂相。3. 2 体细胞体内培养法somatic cell culture in vivo 通过向鱼体内注射细胞分裂剌激物，剌激淋巴细胞大量进入分裂状态。然后，取出肾赃组织在生理盐
5、水中将其撕碎，再加入适当浓度的秋水仙素，或直接向鱼体内注射适当剂量的秋水仙素，从而使细胞分裂阻抑在分裂中期，获得鱼类细胞染色体中期分裂祖二3.3 体细胞直接法direct use of somatic cells 将小鱼浸泡在适当浓度的秋水仙素溶液中，使其分裂旺盛的鲍丝上皮细胞被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂相。3. 4 胚胎细胞直接法directly use of embryo ceJls 选用发育正常的囊胚期或原肠期早期胚胎，将其细胞吹打分散后，加入造当浓度的秋水仙素，阻抑在分裂中期，获得鱼类细胞染色体中期分裂相。3. 5 1 GB/T 18654. 12一2002空气干燥法
6、air-drying technique 将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后斜放静置，待其自然干燥。3. 6 火焰干燥法flame-drying technique 将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后立即将玻片置于酒精灯的火焰上均匀烘烤，或直接将玻片置于火焰上滴片。3. 7 臂比armratio 染色体的长臂长度与短臂长度之比。3.8 相对长度relative length 每条染色体长度与单倍体组染色体总长度之比，以百分值或千分值表示。4 方法提要使用细胞分裂剌激物剌激鱼类淋巴细胞分裂，或者直接收集分裂旺盛媳丝上皮细胞、胚胎细胞。然后利用秋水仙素破坏纺锤丝阻抑在分裂中期，再经低渗、固
7、定、滴片和染色，最后进行镜检分析。5 试剂和材料5. 1 肝素榕液:浓度为500IU/mL。5. 2 小牛或胎牛血清。5. 3 青霉素、链霉素和卡那霉素。5. 4 培养基:TC-199、RPMI-1640或EaglesMEM。培养液配制方法:上述培养基80%加20%小牛或胎牛血清，每毫升培养被含青霉素、链毒素、卡那霉素分别为100IU、100mg和50IU，用碳酸氢铀(NaHC03)洛液调至pH7.2。5.5 植物血球凝集素(PHA)溶液，根据厂家推荐剂量使用。5.6 生理盐水:0.75%氯化铀(NaCl)溶液。注:5.1-5.6中试剂均需经过灭菌。5. 7 秋水仙素溶液:浓度为20吨/mL4
8、0g/mL。5.8 甲醇。5.9 冰乙酸。5. 10 固定液:3份甲醇加1份冰乙酸，现用现配。5. 11 低渗溶液:0.037 5 mol!L氯化饵(KCl)溶液。5. 12 吉姆萨(Giemsa)原液:称O.5g Giemsa粉、甘油33mL，在研钵内用少量甘油与Giemsa粉混合，研磨至无颗粒时，再将剩余甘油倒人，在560C条件下保温2h后，加入33mL甲醇，保存于棕色瓶内。5. 13 磷酸缓冲液(PBS):浓度为0.2mollL，配制方法见表1。表1不同pH值的PBS配方单位为毫升pH值A液0.2mol/L磷酸氢二锅(NazHPO，月B液0.2mol/L磷酸二氢纳(NaHzPO，)J6.
9、 8 49.0 51. 0 7.0 61. 0 39.0 7.2 72. 0 28. 0 7.4 81. 0 19.0 2 GB/ T 18654.12- 2002 6 仪器和设备6. 1 元菌室。6.2 超净工作台。6.3 恒温培养箱或二氧化碳培养箱。6.4 离心机。6.5 天平(感量0.00001 g) 6. 6 显微镜(带显微摄影)。6. 7 照相机。6.8 整套暗室设备。6. 9 游标卡尺(精度0.01mm)。6. 10 温控电热板。6. 11 解剖工具一套。6.12 注射器及针头。6. 13 可调移液器10L200L。6. 14 细口吸管、吸管、5mL10 mL离心管、冰冻及干热载玻
10、片。6. 15 25 mL培养瓶或青、链霉素小瓶，瓶塞等。7 玻片标本的制备7. 1 抽样样品鱼的抽样按GB/T18654.2的规定执行。7. 2 体细胞体外培养法体细胞体外培养法常采用肾组织细胞培养和血细胞培养。本部分仅规定了肾组织细胞培养的操作步骤，血细胞培养的操作步骤参见附录A。7.2. 1 将试样鱼鲤血管剪断，尽量放血。刮去鱼体一侧的鳞片，尤其是解剖部位需刮干净。7.2.2 把鱼放在超净工作台上或无菌室内，铺上消毒纱布，用腆酒和酒精棉球依次消毒己去鳞的部位。7.2.3 吸取3mL5 mL培养液置于青霉素瓶中。7. 2.4 用解剖刀沿脊椎下方(鱼瞟的上面)切开适当长度，用解剖剪将肋骨剪断
11、，露出肾脏。7.2.5 用慑子夹取适量肾组织，放入盛有培养液的青霉素瓶中，将组织块用慑子撕碎，轻轻搅动，然后静置3min5 min.待未撕碎的组织块沉淀。用刻度吸管吸取上部细胞悬液，移入培养瓶内，再加入适量的培养液，使每瓶为4mL或5mL。细胞的密度可根据目测浊度进行粗略调整，或用血球计数板计数后确定，一般为(510)X 105个/mL。7.2.6 用注射器滴加PHA.一般为5mL培养液加O.1 mLO. 2 mL。盖上胶塞，轻轻摇匀。7.2.7 将已接种的培养瓶平放在恒温培养箱或二氧化碳培养箱(此时需拧松瓶塞内。培养温度一般为18C28C ;时间1d5 d。其间，细胞一般分裂14次。可根据具
12、体情况选用合适的培养温度和时间。每天需将培养瓶轻轻摇动12次。7.2. 8 收集细胞:在收集细胞前1.5 h4 h(少数鱼类可提前)，用可调移液器加入秋水仙素溶液，使其终浓度为O.1月/mLO.5g/mL培养液。收集细胞时，先摇动培养瓶，待细胞悬浮，然后将其倒人离心管，再用少量生理盐水将培养瓶内残留细胞洗出，再倒进离心管。7.2.9 低渗:将收集有细胞的离心管以700r/minl 000 r/min离心5min。然后轻轻吸除上清液，约留0.5mL细胞沉淀。加入4mL低渗溶液，用吸管吹打均匀，室温或37C条件下静置35min. 50 min。再加入O.5 mLl mL现配固定液，吹打均匀，以70
13、0r / min. 1 000 r/min离心5min。7.2.10 固定:先吸除上清液，加入少许固定液，吹打均匀，再加入2mL3 mL固定液，静置20min，按3 GB/T 18654.12- 2002 7.2.9规定离心。再重复固定，必要时可重复固定三次。7.2.11 滴片:吸除上清液，加适量现配固定液，将细胞吹打均匀。吸取细胞悬液在45。倾斜的冰冻玻片上滴23滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开。然后将铺散细胞的玻片斜放静置，待其自然干燥，此为空气干燥法。有时为使染色体分散更好，可采用火焰干燥法。7.2.12 染色:用磷酸盐缓冲液(pH=7.2)将Giemsa原液按9: 1稀释，配成工作液(用时
14、配)。取一块干净的玻璃，以略小于玻片长度为间距放置干净玻片作架，将待染的玻片置于染色的容器内，将染液加入，染色10min20 min后取出，用自来水冲去染液，干燥后即可用于观察分析。7. 3 体细胞体内培养法7.3.1 往样品鱼腹腔注射PHA溶液，剂量按厂家推荐剂量使用。然后继续饲养6h120 h o 7.3.2 处死鱼前2h6 h，按1问/g鱼体重腹腔注射秋水仙素溶液。将螺丝血管剪断，尽量放血，取出肾脏组织，放入盛有3mL5 mL生理盐水的青霉素瓶中。将组织块撕碎，用慑子轻轻搅动后静置3 min5 min，待未碎的组织块沉淀，用吸管吸取细胞悬液，加入离心管中。或者不注射秋水仙素，而是先将肾组
15、织取出，撕碎，放入盛有培养液的青霉素瓶中，加入秋水仙素榕液，终浓度为0.1问/mLO.5g/mL培养液，于25C静置2h3 h。然后用慑子轻轻振荡，待稍沉淀后，用吸管吸出上层细胞悬液，加入离心管中。7.3.3 低渗、固定、滴片、染色分别按7.2. 97. 2.12的规定执行。7.4 体细胞直接法此法造用于难以取肾的小鱼。7.4.1 将试样鱼放入含有浓度为0.01%秋水仙素溶液的容器中浸泡6h左右。7.4.2 放血杀鱼，小心把熄片剪下，将鲍丝放入低渗液中低渗20min 30 min。7.4.3 低渗的鲍丝放入甲醇:冰乙酸为9: 1的固定液中浸泡处理7min10 min，再转入100%的冰乙酸中浸
16、泡处理1min2 min。7.4.4 卡诺氏固定液固定23次，每次1h。最后一次可放在常温或冰箱中1h15 h。7. 4.5 滴片前，将固定过的熄丝放入50%的冰乙酸中，用慑子夹住螺丝轻轻振动，使细胞从媳丝上脱落，丢弃鲸弓鲍丝，液体则为细胞悬液。7.4. 6 将细胞悬液滴到控温电热板上50C60C的干净玻片上，5min后吸弃多余液体。7.4.7 染色按7.2.12的规定执行。7.5 胚胎细胞直接法7.5. 1 用大口径吸管挑选发育正常的囊胚期或原肠期早期胚胎。7.5. 2 浮性卵，则用口径稍大于胚胎的小口吸管吸破卵膜，再将胚胎细胞吸入离心管中。粘性卵，则用铲形慑子将卵膜挤破，用吸管将胚胎细胞吸
17、入离心管中。7.5.3 用吸管把胚胎细胞吹打散开，补加生理盐水至4mL5 mL，再加入秋水仙素溶液，终浓度为10g/mL50g/mL。静置15min60 min。7.5.4 低渗按7.2.9规定执行。7.5. 5 固定、滴片、染色分别按7.2. 107. 2.12规定执行。8 组型分析8.1 染色体数的确定在油镜下选取50100个分散良好，形态清晰，数目完整的分裂相，计数每个分裂相的染色体数目，找出染色体数目的众数，并计算众数所占百分比，据此确定鱼的染色体数。8.2 染色体分组和臂数的计算8.2.1 鱼类染色体分组一般按臂比将染色体分为四组:a)中部着丝粒染色体m组，臂比为1.001. 70
18、; 4 b)亚中部着丝粒染色体sm组，臂比为1.71 3. 00 ; c)亚端部着丝粒染色体st组，臂比为3.01 7. 00 ; d)端部着丝粒染色体t组，臂比为7.01。GB/ T 18654.12-2002 8.2. 2 染色体臂数(NF)的计数:中部和亚中部着丝粒染色体的臂数计为2，亚端部和端部着丝粒染色体的臂数计为1。8. 3 染色体分组方法在油镜下选取1015个数目完整，分散良好，长度适当(正中期)，着丝粒清楚，两条染色单体适度分开，形态清晰的分裂相进行显微摄影。显微摄影的有关事项参见附录B。在照片上用游标卡尺测量每条染色体的长臂和短臂长度，按8.2.1的规定将染色体分组，并按8.
19、2.2的规定确定染色体臂数，得出核型公式，然后计算得出核型指数，包括臂比和相对长度。选取其中形态最好，最有代表性的一个分裂相，分别剪下各条染色体，按臂比和相对长度，大小配对，并按m，sm、st和t组顺序排列，每组内染色体按相对长度从大到小排列、贴好，然后翻拍。8. 4 核型公式根据对十个以上的中期分裂相染色体测量分组等分析的结果，就可确定该种鱼类的染色体数目，染色体分组情况，染色体臂数和染色体的相对长度。表示这一结果的表达式称为核型公式。示例:某鱼的核型公式为2n=48，26m+14 sm+8 st，NF=88。8. 5 其他形态特征的观察除计数和分组外，还需观察染色体的其他形态特征，如有无异
20、形染色体对，次缝痕，随体等，并计入结果。5 GB/ T 18654.12- 2002 A.1 环境条件附录A(资料性附录)血细胞培养法试验操作在元菌室或超净工作台上进行。A.2 取样元菌采血，尾静(动)脉采血或心脏采血均可。A. 3 淋巴细胞培养A.3. 1 用注射器沿离心管壁滴加肝素溶液，湿润管壁，每支离心管加o.1 mLO. 3 mL。A. 3. 2 将取有无菌血液的注射器针头取下，弃去最初的23滴血，把其余的血液滴入上述离心管(勿将血泡沫滴入)，盖上胶塞。4C冰箱中静置2h左右，待血液分层，或者将上述装好血液的离心管以300 r/min离心3min5 min，使其沉淀分离。A. 3. 3
21、 用刻度吸管移取3mL5 mL培养液于培养瓶中，加入淋巴细胞，再添加适量培养液调整细胞密度为(510)X 105个/mL。A.3.4 用注射器按O.1 mL/ 5 mLO. 2 mL/5mL培养液滴加PHA，轻轻吹打，使培养液和细胞渴匀，再用刻度吸管分装，每瓶5mL，盖上瓶盖。A. 3. 5 将已接种的培养瓶平放在恒温培养箱或二氧化碳培养箱(此时应尽量保持无菌状态并拧松瓶盖)内，培养温度依鱼的种类不同而有所不同，一般为18C28C，时间1d5 d，每天需将培养瓶轻轻摇动12次。A.4 微量全血培养A. 4. 1 用刻度吸管把适量培养液移入培养瓶内，再用注射器滴加PHA至0.1mL/ 5 mL
22、0. 2 mL/ 5 mL培养液，泪匀后分装，25mL培养瓶每瓶4.7 mL4. 9 mL;青、链霉素瓶可酌情少装。A. 4. 2 把抽取有无菌血液的注射器针头取下，排掉最初12滴血液，25mL培养瓶每瓶滴加O. 1 mLO. 3 mL血液，盖上瓶盖，摇匀。A. 4.3 培养按A.3. 5的规定执行。A. 5 收集细胞、低渗、固定、滴片、染色分别按7.2. 87. 2.12规定执行。B.1 显微镜的调节附录B(资料性附录)显微摄影的有关事项B. ,. 1 把10X物镜旋入光路中，调节双目镜筒使两目镜间距离符合使用者两眼间距离，再调节调焦取景目镜光度视力调节环至调焦标志成像清晰;然后用粗细调焦钮
23、把标本的像调焦清晰。6 GB/T 18654. 12- 2002 B. 1.2 聚光镜调中，关小视场光栅，升降聚光镜使所得到的多边形的视场光栅像清晰，再用聚光镜上的调中旋钮将视场光栅调至视野中央，开大视场光栅后进一步调中至与视野圆周内接，继续开大光栅至视野外切，即稍大于视野。B. 1. 3 将孔径光栅开至与物镜的数值孔径CN.A)相应位置:一般情况下，聚光镜的孔径光栅应比物镜的孔径光栅小二分之一左右，才能获得最好质量的像。调换物镜时孔径光栅也必须相应调整(聚光镜与物镜数值孔径的匹配是显微摄影的关键操作)。B. 1. 4 再把标本精确调焦后即可准备拍摄。B. 2 黑白感光片及相纸的选择一般黑白感
24、光片为210，为提高反差建议使用15。左右的胶卷，使用4号相纸。NOON-P.叮的H阁。华人民共和国家标准养殖鱼类种质检验第12部分:染色体组型分析GB/T 18654. 12-2002 国出，9峙中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售 印张3/4字数15千字2002年6月第一次印刷开本880X12301/ 16 2002年6月第一版印数1-800祷定价10.00网址7巳书号:155066 1-18490 606- 574 版权专有侵权必究举报电话:(010)685335339峰科目 GB/T 18654.12-2002
