1、lCS 65150B 50中华人民 共和，、7_。a亘国国家标准GBT 1 86541 42008养殖鱼类种质检验第1 4部分：DNA含量的测定20080627发布Inspection of germplasm for cultured fishesPart 1 4：Determination of DNA content200810-01实施车瞀鹛紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19刖 罱GBI、18654(养殖鱼类种质检验分为下列部分第1部分：检验规则；第2部分：抽样方法；第3部分：性状测定；第4部分：年龄与生长的测定；第5部分：食性分析；第6部分：繁殖性能的测定；第7部分：生态
2、特性分析；第8部分：耗氧率与临界窒息点的测定；第9部分：含肉率测定；第10部分：肌肉营养成分的测定；第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定；第12部分：染色体组型分析第13部分：同工酶电泳分析；第14部分：DNA含量的测定；第15部分：RAPD分析；本部分为GBT 18654的第14部分。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全围水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：上海水产犬学、中国水产科学研究院长江水产研究所。本部分主要起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹曙明。GBT 18654142008养殖鱼类种质检验第14部分：DNA含量的测定GBT 1865414
3、20081范围GBT 18654的本部分规定了鱼类脱氧核糖核酸(DNA)含虽测定的试剂与材料、仪器和设备、抽样、分析步骤和结果判定。本部分适用于常见淡水、海水养殖鱼类。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 18654的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 186541 2002养殖鱼类种质检验第l部分：检验规则GBT 186542养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法3试剂与材料除非另有说明
4、，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。31磷酸氢二钠(NazHPOt)。32二个结晶水的磷酸二氢钠(NaHzPO-2Hzo)。33生理盐水：075氯化钠(NaCI)溶液。34固定液：3份甲醇加人1份冰乙酸，现配现用。35肝素溶液：浓度为500 IUmL。36胰酶：浓度为5 mgmL。37核糖核酸酶(RNase)：l mgmI。38碘化丙啶(PI)：浓度为50 btgmL。39 01 molL磷酸缓冲液(PBS)：Na2HP041235 g、NaH2P042H zO 203 g，蒸馏水定容至1 I。4仪器和设备41离心机：转速为5 000 rmin，常温。42流式细
5、胞仪。43 10 mL离心管及试管架。44 5 mI，试管及试管架。45吸管。46 2mL注射器。47 5号针头。48锦纶筛网(或涤纶筛网)：规格为80 j：Lcm。49封口膜。1GBT 186541420085抽样51 试验鱼抽样按GBF 186542的规定执jt。52样晶数量达10尾以上。53用洒精棉球将鱼体尾部待采血部位擦试消毒，用装有少最肝素溶液的注射器在足动(静)脉处取02 mL1，0 mL血液为试样。另用注射器在小公鸡(Gallus sp)翅静脉处取2 mI。血液作对照用。6分析步骤61样品处理611 采好的血样立即注入装有5 mI。生理盐水或磷酸缓冲液的离心管中，用吸管反复吹吸洗
6、涤。612 500 rmin离心5 min，待血球沉淀后，用吸管将二清液及上层的白血球吸出。613加人生理盐水或PBS吹吸洗涤，离心5 min，吸除上清液。614混匀剩余的J：清液及血球，慢慢滴人5 mL同定液中同定，用封u膜封好待用。62染色621 固定后的血样，包括鱼血样和对照鸡I【L样，800 rmin离心2 min，吸除I：清液，用生理盐水或PBS制成细胞悬浮液，静止1 h以I：。622 800 rmin离心2min，吸除上清液。623每一血样加入18 mL胰酶液作用10 min，再加入15 mL RNase溶液作用10 min，最后加入15mI碘化丙啶溶液染色15min以上。624用
7、规格为80fLcm的锦纶筛网(或涤纶筛刚)过滤，并将细胞浓度调到l108个ml，左右备测。63对照血样及计算方法631用鸡红血球(2c一23pg)做标准DNA对照，依各种鱼DNA含量的不同，可选择内定标或外定标。632用流式细胞仪进行测定，每m样测量3 000个细胞以上，用流式细胞仪的相关软件处理测得鱼红血球与对照鸡红血球的消光值。633血样的DNA含量按式(1)计算：，)一鲁2 3式中：P 鱼血样中的DNA含量，单位为皮克(pg)；E。 鱼红血球消光值；E】鸡红血球消光值。7结果判定71个体测定结果的判定按GBT 186541 2002中61的规定执行。将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合标准规定的判定为合格；凡与标准规定有缸著差异或不符合标准的判定为不合格。72样品群体的判定根据71的判定结果，计算出被检样品中合格品的百分率，用表示。
