1、ICS 65150B 50 鳕亘中华人民共和国国家标准GBT 1 86541 520082008-06-27发布养殖鱼类种质检验第1 5部分：RAPD分析Inspection of germplasm for cultured fishesPart 1 5：RAPD analysis2008-10-01实施车瞀髅鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19刖 昌GBT 18654(养殖鱼类种质检验分为下列部分第1部分：检验规则；第2部分：抽样方法；第3部分：性状测定；第4部分：年龄与生长的测定；第5部分：食性分析；一第6部分：繁殖性能的测定；一第7部分：生态特性分析；第8部分：耗氧率与临界窒
2、息点的测定；第9部分：含肉率测定；一第10部分：肌肉营养成分的测定；第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定；第12部分：染色体组型分析；一第13部分：同工酶电泳分析；一第14部分：DNA含量的测定一一第15部分：RAPD分析；本部分为GBT 18654的第15部分。本部分的附录A、附录B和附录C为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：上海水产大学、中国水产科学研究院长江水产研究所。本部分主要起草人：李思发、邹曙明、徐忠法、赵金良、蔡完其。GBT 186541520081范围养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析
3、GBT 1 86541 52008GBT 18654的本部分规定了鱼类RAPD分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样、分析步骤和结果判定。本部分适用于常见淡水、海水养殖鱼类。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 18654的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 186541 2002养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GBT 186542养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法3原理利用10碱基的随
4、机寡核苷酸引物，对样品基因组的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分离和溴化乙锭染色，根据谱带多态性比较分析，判定鱼类物种的遗传特性。4试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。41 三羟甲基氨基甲烷(Tris)。42氢氧化钠(NaOH)。43氯化钠(Nacl)。44十二烷基磺酸钠(sDs)。45氯化钾(KCl)。46氯化镁(MgCl：)。47 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。48硼酸。49琼脂糖。410蔗糖。411明胶。412溴化乙锭(EB)。413蛋白酶K。414 RNA酶A(无DNA酶活性)。415 Taq酶。416 DNA Marker。
5、417石蜡油。1GBI18654152008418无水乙醇。419 95乙醇。420 70乙醇。421平衡酚。422三氯甲烷。4。23异戊醇。424浓盐酸。425 TrisHC缓冲液：配制方法见附录A。426 0，5 moiL EDTA溶液：配制方法见附录A。427 5 molL NaCI：配制方法见附录A。428 STE缓冲液：配制方法见附录A。429 10SDS溶液：配制方法见附录A。430 20 mgmL蛋白酶K溶液：配制方珐见附录A。431 25 mgmL RNA酶A溶液：配制方法见附录A。432 PCR扩增缓冲液(10)：配制方法见附录B。433 TBE电泳缓冲液(10x)：配制方法
6、见附录c。434 05 mgmL溴化乙锭溶液(1 000X)：配制方法见附录C。435加样缓冲液(6)：配制方法见附录c。436溴酚蓝。5仪器和设备51 PCR扩增仪。52高速低温离心机。53电子天平，感量为0000 1 g。54紫外透射分析仪。55照相器材。56凝胶成像系统。57恒温水浴锅。58烘箱。59低温冰箱及普通冰箱。510 05 ffLl 000 pL取样器(1套)，511样品混合器。512微波炉。513高压湿热灭菌锅。5。14紫外分光光度计。515 02 mL薄壁离心管(PCR扩增用)。516 15mL离心管。517解剖用具(镊子、剪刀，手术刀、搪瓷盘)。518陶瓷研钵。519玻璃
7、组织匀浆器。520一次性手套。521水平电泳仪(1套)。522凝胶灌制平台。2GBT 18654152008523凝胶样品梳。524胶带。525直流电源。6抽样61试验鱼抽样按GBT 186542的规定执行。62样品数量为30尾50尾。63取01 g肌肉、肝脏、鳍条等新鲜样品，于液氮、干冰及一30以下低温保存，或于95乙醇中保存。7分析步骤71基因组DNA的提取取01 g样品，视保存方式而采用剪碎、液氮碾碎或匀浆器磨碎样品，放入15 mL离心管内，加人400 pL sTE缓冲液。再加入终浓度分别为1的SDS和100 pgmL300-tgmL的蛋白酶K，混匀后，56作用5 h-15 h。混合液中
8、加入等体积饱和酚，于样品混合器上缓慢转动05 h-1 h，待充分混匀后，i0 0009离心8 min，吸取上清液；加入等体积的混合液(酚、三氯甲烷、异戊醇三者之比为25 t z4：1)，缓慢转动05 h，离心后吸取上清液；加入等体积的三氯甲烷，缓慢转动5 rain，离心后吸取上清液；加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，缓慢转动几分钟，产生絮状DNA沉淀，静置5 min后，低速(1 0009-1 5009)离心5 min，获得DNA沉淀。DNA沉淀用70的乙醇洗涤，干燥，加入500 pL无菌重蒸水或TE溶解，再加入25 mgmL的RNA酶A溶液(无DNA酶活性)2 pL，于37温育1 h后，
9、置于4冰箱保存备用。使用紫外分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测样品的纯度与浓度。紫外分光光度计检测的OD2s。OD2”值应在L 618范围内，电泳检测显示DNA长度应大于50 kb。DNA样品的浓度约为100 ngpL。72基因组DNA的PCR扩增在02 mL薄壁管中加下列PCR反应混合液(反应总体积为25 pL)：15 pL30 pL PCR扩增缓冲液，l pL 25 mmolL dNTP混合液，l pL2 pL 5 tLmolL引物，约25 ng150 ng基因组DNA，06 u1 U Taq酶。离心后，再加入约30 pL石腊油防止挥发。离心后于PCR扩增仪上反应，循环程序为：第一个程序为93
10、94变性5 rain，第二个程序为939445 s，3645 s，7290 s，40个45个循环后，72延伸10 rain。扩增产物直接电泳或4暂时保存(一般不超过6 h)至电泳分析。73 PCR扩增样品的电泳分析1。5琼脂糖凝胶的制备：称取适量琼脂糖(电泳级)置于三角瓶中，加入TBE电泳缓冲液混匀，在微波炉中加热熔化，需要时可加人溴化乙锭，制成05 pgmLEB染色液的凝胶，冷却至55，倒入已用胶带封好的凝胶灌制平台，插上样品梳。待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放人电泳槽中，TBE缓冲液高出凝胶表面约1 mm5 mrfi。取10 pL PCR扩增产物加适量的加样缓冲液，混匀，然后
11、用移液器将样品加入样品孔中。DNAMarker同时点在旁边的孔中。接通电源，使DNA向阳极移动，在1 Vera-10 Vcm的电压下进行电泳。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。GBT 18654152008用05 pgmL的EB染色10 min30 min后在凝胶成像系统上记录(已加入EB染色液的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察、照相)。74结果分析741 种、亚种或地理群体RAPD遗传图谱的建立及寻找特征标记引物选择条带清晰、重复性佳的引物(一般以20个以上引物为准)，对每群体30个50个样本进行PCR扩增。建立该种、亚种或地理群体RAPD标准遗传图谱。并寻找出
12、尽可能多的可以用来区分种间、亚种间、地理群体间的特征标记条带。742种、亚种或地理居群内的遗传相似度的计算经电泳获得基因组遗传图谱，在同一电泳迁移位置上，有DNA扩增条带的计为1，没有的计为0。个体间遗传相似度(F)按式(1)计算：F一!丛， N：+N。式中：F个体z和Y间的遗传相似度；N=y个体z和Y共同拥有的带数；l个体z所具有的总带数；N，个体Y所具有的总带数。种、亚种或地理居群内的平均遗传相似度通过对群体内各个体问的遗传相似度平均而求得。8结果判定81个体测定结果的判定按GBT186541 2002中61的规定执行。将所有测定结果逐一与该种、亚种或地理群体RAPD标准遗传图谱和特征标记
13、条带进行对照，凡符合标准规定的判定为合格；凡不符合标准或与标准规定有显著差异的判定为不合格。82样品群体的判定根据81的判定结果，计算出被检样品中合格品的百分率。4A1 1 molL Tris-HCI缓冲液(需灭菌)附录A(规范性附录)DNA提取液的配制GBT 18654152008取800 mL重蒸水中溶解121 g Tris碱，用浓盐酸调至pit80，混匀后加重蒸水至1 L。A2 05 molL EDTA溶液(iil灭菌)取700 mL重蒸水中溶解1861 g NazEDTA2H 20，用10 molL NaOH调至pH8o(约50 mL)，补加重蒸水至1 L。A3 5 molL NaCI
14、(需灭菌)取1 000 mL重蒸水中溶解292 g NaCl。A4 STE缓冲液30 mmolL TrisHCI(pH8O)，200 mmolL EDTA，50 mmolL NaCl。A5 10SDS溶液取900 mL重蒸水溶解100 g电泳级SDS，加热至68助溶，调节pH至72，定容至1 L，分装备用。A6 20mgmL蛋白酶K溶液蛋白酶K 20 mg溶解于1 mL无菌重蒸水中，分装后20保存。A7 25mgmLRNA酶A溶液25 mg无DNA酶活性的RNA酶A溶解于1 mL无菌重蒸水中，一20保存。5GBT 186541520086附录B(规范性附录)PCR扩增缓冲液PCR扩增缓冲液：100mmolLTrisHCI(pH90)，500mmolLKCI，300mmolLMgCl2，0001明胶。附录C(规范性附录)电泳缓冲液c1 TBE电泳缓冲液108 gTris，55 g硼酸，40mL 05molLEDTA(pH8O)。C2 05 mgmL澳化乙锭溶液50 mg溴化乙锭，100 mL重蒸水。c3加样缓冲液025溴酚蓝，40(质量浓度)蔗糖水溶液。CBT 18654152008
