1、ICS 67.180.20 X 11 岳重登中华人民共和国国家标准GB/T 20373-2006/ISO 11213: 1995 变性淀粉中乙酷基含量的测定酶法Modified starch-Determination of acetyl content-Enzymatic method (lSO 11213:1995 ,IDT) . | . . . . | . . . | | . EE- | . . EE- | . . | | . | EE- | . 061214000048 2006-03-14发布2006-10-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局串舍中国国家标准化管理委员会&
2、叩中华人民共和国国家标准变性淀粉中乙酷基含量的测定酶法GB/T 20373-2006/1S0 11213: 1995 峙中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X12301/16 印张O.75 字数15千字2006年11月第一版2006年11月第一次印刷司除书号:155066 1-28228 定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 20373-2006/180 11213: 1995 前本标准
3、等同采用ISO11213: 1995(变性淀粉中乙眈基含量的测定一一酶法(英文版)，其内容和结构与ISO11213: 1995一致。本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由中国商业联合会提出。本标准由中国商业联合会商业标准中心归口。本标准起草单位:江南大学食品学院、吉林淀粉批发市场、中国淀粉工业协会变性淀粉专业委员会。本标准主要起草人:顾正彪、洪雁、张燕萍、陈洪兴、钟立满、周心怡。I GB/T 20373-2006/ISO 11213: 1995 变性淀粉中乙酷基含量的测定酶法1 范围乙酷基含量，通过计算得结合的乙本方法适用于测定乙酷基缉不超42 规范性引用文件下列文件中的条卦的修改单(
4、不包括勘、GB/ T 6682一3 原理(CS)的作用下，革酷乙酸是4 试荆与材料与BoehringerMannheim酶质茸相当。注1:可用适当的商用酶试剂盒。4. 1 盐酸(HCI)溶液c= 1 mol/L。4.2 氢氧化制(NaOH)溶液c=5 mol/L。4.3 缓冲溶液在大约70mL蒸馆水中，溶解下列试剂:7.5 g 三乙醇胶(三起乙基胶); 420 mg L-苹果酸;210 mg 氧化镇(MgClz.6H20)。乙酷辅酶A合拧攘酸合成酶法测定过滤液中的规定的二级。所用的酶应需加入大约8mL 5 mol/L的氢氧化饵溶液，使缓冲液的pH维持在8.4。此溶液在40C下，可稳定贮存一年。
5、GB/T 20373-2006/ISO 11213: 1995 4.4 ATP-CoA-NAD溶液在20mL水中，溶解下列试剂z500 mg ATP-Na2 H2-3H20(质量分数为98%); 500 mg 无水碳酸氢铀(NaHC03); 50 mg 冷冻干燥的CoA三惶盐(CoA的质量分数约为85%); 250 mg 冷冻干燥的游离NAD水化物。-NAD.H20的质量分数98%)。该溶液在40C下，可稳定贮存一周。4.5 MDH-CS分散悬浮液分散约1100 U(国际单位)的苹果酸脱氢酶(MDH来自于猪心，酶学编号为EC1. 1. 1. 37)和约270 U的拧攘酸合成酶(CS来自于猪心，
6、酶学编号为EC4. 1. 37)于0.4mL浓度为3.2mol/L的硫酸镀(NH4)2S04J溶液中。该溶液在40C下，可稳定贮存一年。注2:在25C下，一个国际单位(1U)l min可催化1mol的底物。4.6 ACS溶液榕解20mg冻干的并含有5mg乙酷辅酶A合成酶(ACS来自酵母，EC6. 2. 1. 1.约16U)于0.4 mL水中。该溶液在40C下，可稳定贮存5天。5 仪器5. 1 锥形瓶:250mL.带螺旋帽。5.2 沸水浴:带振荡器。5.3 容量瓶:200mL。5.4 微量移液器或注射器。5.5 分光光度计:能在340nm波长处操作。5.6 比色杯:石英玻璃或其他在340nm处可
7、透光的材料，厚度为10mm士0.1mm。5. 7 试验筛:孔径为800m。5.8 螺旋式磨粉机。5.9 水浴:20oC250C。6 样晶的制备将样品过孔径为800m筛(5.7)。样品不能通过筛子部分，再用螺旋式磨粉机(5.8)研磨，至其全部通过800m筛。充分混匀样品。7 操作方法7. 1 乙酷基的水解7. 1. 1 颗粒状淀粉的分散称取约1g(精确至0.001g)待测实验样品，置于250mL锥形瓶(5.1)中，加入50mL盐酸(4.1).搅拌至较好的分散状态。后续步骤见7.1.3。7. 1.2 预糊化淀粉的分散加50mL盐酸(4.1)至250mL锥形瓶(5.1)中，在锥形瓶中加入搅拌子后，置
8、于磁力搅拌器上开始搅拌，缓慢并小心地加入约1g(精确至0.001g)待测实验样品，确保样品的分散均匀。7. 1. 3 水解和过洁、将锥形瓶盖上塞并放入沸水浴中(5.2) .振荡30mino 2 GB/T 20373-2006/1S0 11213: 1995 取出锥形瓶，放入冰水浴中快速冷却至200C:l:5C。完全冷却后，打开塞子，加入10mLNaOH溶液(4.2)，混匀。将样品转移至200mL的容量瓶(5.3)中，用蒸锢水定容。将容量瓶放置于20C250C 的水浴(5.9)里(淹没刻度线)，使温度平衡。用合适的滤纸过滤，弃去最初的20mL30 mL滤液，其余作为7.4所示的酶法测定潜液。7.
9、2 游离乙酷基测定7.2. 1 颗粒状淀粉的分散称取10g待测实验样品，边搅拌边加入装有100mL蒸馆水的锥形瓶(5.1)中，后续步骤见7.2.3。7.2.2 预糊化淀粉的分散在锥形瓶(5.1)中加入100mL蒸馆水，放入磁力搅拌器的搅拌子并开始搅拌，缓慢并小心地加入约2g(精确至0.001g)待测实验样品，确保分散均匀。7.2.3 溶解和过滤盖上锥形瓶塞子并振荡30min。将样品转移至200mL的容量瓶(5.3)中，用蒸懵水定容。将容量瓶放置于200C 250C的水浴(5.9)里(淹没刻度线)，使温度平衡。用合适的滤纸过滤，弃去最初的20 mL30 mL滤液，其余作为7.4所示的酶法测定溶液
10、。7.3 验证实验为验证本方法，可以用纯的无水醋酸铀等试样作参考。称取约100mg(精确至0.1mg)无水醋酸铀(乙酷基的质量分数为52.4%)，放入1000 mL容量瓶中，用蒸馆水定容，将容量瓶放置于20C 250C的水浴(5.的里(淹没刻度线)，使温度平衡，后续步骤见7.407.4 乙酸的酶法测定根据以下的分析测试条件进行乙酸的酶法测定:一一波长:340nm; 一一温度:200C250C。比色杯(5.6)中装有蒸馆水为参照，读取吸光值。注3:也可以在下列波长下进行测定，但计算中要考虑摩尔吸光系数一-Hg灯，365nm:x=3. 4 L. mmol-1 cm一1; 一-Hg灯，334nm:x
11、=6. 18 L mmol-1 cm斗。将一定体积(见表1)的样品放于比色杯(5.的中进行测定。表1Z酸酶法测定的分析方案试剂和作用量空白缓冲溶液(4.3)1. 00 mL ATP-CoA-NAD溶液(4.的0.20 mL 双重蒸馆水2.00 mL 待测溶液混合每个比色杯中的样品，读出吸光值Ao，在每个比色杯中加入MDH-CS悬浮液(4.5)0.01 mL 混合每个比色杯中的样品，3min后读出吸光值Al。在每个比色杯中加入下列试剂，让其反应ACS溶液(4.6) 0.02 mL 样品溶液1. 00 mL 0.20 mL 1. 50 mL 0.50 mL 0.01 mL 0.02 mL 混合每个
12、比色杯中样品，等反应停止(大约需用10min15 min) ，读出吸光值A，。如果15min后反应不能停止，每隔2 min读吸光值一次，直至每2min吸光值增加幅度不变。注:样品溶液的体积可以根据乙酸基的含量的高低适当调节，但最终总的体积应维持在3.23mL , 3 GB/T 20373-2006/180 11213: 1995 8 结果计算8. 1 吸光值之差通过式(1)计算出吸光值之差:r / A A (Aj -Ao) l r / A A (A j -Ao) l A= 1 (A2- Ao) , -:l .:U 1_ 1 (A2-Ao) b -:l .:U. 1 ( 1 ) L fl:2 -
13、 .).0 ) 5一(A2-Ao ) , J- L r12 -r10Jb一(A2-AO) bJ 式中:A-吸光值之差;A。、Aj、A2一一通过表l中的各分5一一含有样品的溶液b一-空白溶液。8.2 总的乙酷基含量通过式(2)计算出总式中:A-根据8mj-一待测Wm一一样品当样品溶液被定容至1000 m 注4:公式的推再万18. 3 游离乙酷基通过式(3)计算式中:叫一一待测样品中M、和Wm的含义与8:m2一-待测样品的质量(8.4 结合乙酷基含量的测定通过式(4)计算出结合乙酷基的含量:W b. = W.一-WfWb.一一待测样品中的结合乙酷基质量分数，%;W.一一待测样品中总的乙酷基质量分数
14、，%;Wf一一待测样品中游离的乙酷基质量分数，%。9 精密度。因待测溶液. ( 4 ) 方法的精密度由ISO/TC93 / WG 3在1990年组织的化学基础实验室合作实验中确定，并贯彻执行符合GB/T6379(参见参考文献2J)。这次实验有11个实验室参与进行:样品为玉米变性淀粉，马铃薯变性淀粉，小麦变性淀粉。这次实验统计结果的摘要参见附录B。当重复限和再现限确定时，其置信度为95%。4 GB/T 20373-2006/ISO 11213: 1995 9. 1 重复性在很短的时间间隔内，在同一实验室中由同一实验者采用同样的仪器、同样的材料、同样的方法进行的两个独立的实验结果的绝对差值不应超过
15、两个结果中较高值的5%。9.2 再现性在不同实验室由不同实验者采用不同仪器、相同材料、相同方法进行的两个独立实验得到的绝对差值不应超过两个结果中较高值的8%。10 实验报告实验报告要列出:一一参考的标准;一一取样方法;一一实验方法;一一得到的实验结果;一一若重复性已被核还应提及在本标吃果的细节。实验报告需包F。川5 GB/T 20373-2006/ISO 11213: 1995 6 附录A(资料性附录)Z酷基含量计算公式通过式(A.1)可以计算得到待测溶液中总的乙酷基质量浓度(g/L): A1, X Vz X A Pat 1 A rr, ./TT ,/ J ( A. 1 ) 式中tPat 待测
16、溶液中总的乙酷基的质量浓度，单位为克每升(g/L); M , 乙酷基的摩尔质量，M，=43g/mL; V1一一一待测溶液的体积，V1=0.50 mL; Vz一一-样品洛液的最终体积，Vz=3.23 mL; A-根据8.1所计算得到的吸光值之差;d一一比色杯的厚度，d=lcm; 一-NADH在340nm处的摩尔吸光系数，X=6.30 L. mmol-1 cm一1。通过式(A.2)可以计算得到湿基样品中总的乙酷基含量:H 10 X ml 式中:Wah 湿基样品中总的乙酷基的质量分数，%;Pat 待测溶液中总的乙酷基的质量浓度，单位为克每升(g/L); V3 过滤前待测溶液的体积，V3=200mL;
17、mj一一待测样品的质量(见7.1.1或7.1.2)，单位为克(g)。由此可以得到:A1, X V2 X A ， V3 冒一Wah 1 000 X V1 X d X10 X ml 43 X 3. 23 X 200 X A 1 000 X O. 50 X 1 X 10 XXmj 5.56XM Xml 通过式(A.的可以计算得到干基样品的总的乙酌基含量:.( A. 2) .( A.3 ) , 100 5.56XA , 100 a = Wah X一一一一一一=-X( A.4 ) H ， 100 - Wm X X mj 100 - Wm 式中tWm一一样品水分的质量分数，%。GB/T 20373-200
18、6/ISO 11213: 1995 附录B(资料性附录)实验室间实验结果统计表B.1 实验室间实验结果统计样nEn Za 参数WL ML MH PL PH 消去异常数据后的实验室数目10 10 10 11 11 有异常数据的实验室数目l 1 1 。可接受的实验结果20 20 20 22 22 乙酷基平均含量/(%)(质量分数)1. 00 O. 70 1. 19 0.61 1. 92 重复性标准偏差S，/(%) (质量分数)0.006 0.013 0.013 0.007 0.050 重复性变异系数/(%)0.6 1. 9 1. 08 1. 20 2.61 重复性限rr=2.8Xs，J/(%)(质
19、量分数)0.017 0.037 0.036 0.021 O. 142 再现性标准偏差SR/(%)(质量分数)0.009 0.015 0.020 0.024 0.088 再现性变异系数/(%)0.95 2.16 1. 69 3.97 4.60 再现性限R(R=2.8XSR)/(%)(质量分数)0.027 0.042 0.057 0.069 0.250 a H:高含量:L:低含量:M:变性玉米淀粉;P:变性马铃薯淀粉pW:变性小麦淀粉。GB/T 20373一2006/1S011213:1995 参考文献lJ Bergmeyer, H. U.酶法分析方法(第二版)，1974，1:112-117. 2J GB/T 6379一1986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准方法的重复性和再现性.版权专有侵权必究 书号:155066 1-28228 GB/T 20373-2006 定价:10.00元白白白F的FNFF。自OON-mhgNH阁。
