1、ICS67.10053中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T240208原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法Rapidetrm inationofm elam ineinrawm ilkHighperform anceliquidchrom atgraphym ethod208-10-5发布 208-10-5实施中 华人 民共 和国 国家 质量 监督 检验 检疫 总局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发布发布发布发布G B / T 22400 2008I前 言本标 准的 附录 A 为资 料性 附录 。本标 准由 中国 计量 科学 研究 院提 出。本标 准由 全国 仪器
2、分析 测试 标准 化技 术委 员会 归口 。 本标 准 主要 起草 单位 ：中 国计 量科 学研 究院 。本标 准参 加起 草单 位： 陕 西 出入 境检 验检 疫局 、 中国 人民 解放 军总 医院 、 北京 市产 品质 量监 督检 验所 、 国 家 地质 实验 测试 中心 、 北 京 理工 大学 、 北 京 出入 境检 验检 疫局 、 北 京 大学 、 北 京 市 营养 源研 究 所 、军事 医学 科学 院、 北京 科技 大学 、清 华大 学 。本标 准主 要起 草人 ： 李红 梅、 张 庆 合、 汤 桦 、 何 雅娟 、 全 灿、 李 秀 琴、 黄 挺 、 苏 福海 、 戴 新华 、 马
3、康、 李晓 敏、 宋德 伟、 徐蓓 。G B / T 22400 20081原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法1 范围 本标 准规 定了 液相 色谱 法快 速检 测 原料 乳中 三聚 氰胺 的方 法。本标 准适 用于 原料 乳， 也适 用于 不含 添加 物的 液态 乳制 品。 本标 准 定量 检测 范围 为 0. 30 m g/ kg 100 .0 m g/ kg ，方 法检 测限 为 0.05 m g/ kg 。注：当原料乳中三聚氰胺的含量大于 1 0 0 . 0 m g / k g 时，具体操作方法见 6 . 2 . 2 . 3 . 2 。2 规范 性引 用文 件 下列 文件 中的 条款
4、 通过 本标 准的 引用 而成 为本 标准 的条 款。凡 是 注日 期的 引用 文件 ，其 随 后所 有 的修改 单 （ 不 包括 勘误 的内 容） 或 修 订版 均不 适用 于本 标准 ， 然 而 ， 鼓 励 根据 本标 准达 成协 议的 各方 研 究是否 可使 用这 些文 件的 最新 版本 。凡 是不 注日 期的 引用 文件 ，其 最新 版本 适用 于本 标准G B / T 6379.1 测量 方法 与结 果的 准确 度（ 正确 度与 精密 度） 第 1 部分 ：总 则与 定义G B / T 6379.2 测量 方法 与结 果的 准确 度 （ 正 确度 与精 密度 ） 第 2 部分 ： 确
5、 定 标准 测量 方法 重复 性 与再现 性的 基本 方法 G B / T 6682 分析 实验 室用 水规 格和 实验 方法3 原理用乙 腈作 为 原料 乳中 的蛋 白质 沉淀 剂和 三聚 氰胺 提取 剂，强 阳 离子 交换 色谱 柱分 离，高 效 液相 色 谱- 紫外 检测 器 / 二极 管阵 列检 测器 检测 ，外 标法 定量 。4 试剂 和材 料 除另 有说 明外 ，所 用试 剂均 为分 析纯 或以 上规 格， 水为 G B / T 6682 规定 的一 级水 。4.1 乙腈 （ C H3 C N ） ：色 谱纯 。4.2 磷酸 （ H 3 P O 4 ）。4.3 磷酸 二氢 钾 （
6、K H 2 P O 4 ）。4.4 三聚 氰胺 标准 物质 （ C 3 H 6 N 6 ）： 纯度 大于 或等于 99% 。4.5 三聚 氰胺 标准 贮备 溶液 ： 1 .0 0 1 03 m g/ L 。称取 100 m g 三聚 氰胺 标准 物质 （ 准确至 0.1 m g ） ， 用 水 完 全 溶 解 后 ， 100 m L 容量 瓶中 定容 至刻 度 ，混匀 ， 4 条件 下 避光 保存 ，有 效期为 1 个月 。4.6 标准 工作 溶液 ：使 用时 配制 。4.6.1 标准 溶液 A ： 2.00 1 02 m g / L 。准确 移取 20 .0 m L 三聚 氰胺 标准 贮备
7、溶液 （ 4.5 ） ， 置于 100 m L 容量 瓶中 ， 用 水 稀释 至刻 度， 混 匀 。4.6.2 标准 溶液 B ： 0.50 m g / L 。准确 移取 0.25 m L 标准 溶液 A （ 4. 6.1 ） ，置于 100 m L 容量 瓶中 ，用 水稀 释至 刻度 ，混 匀。4.6.3 按表 1 分别 移取 不同 体积 的标 准溶液 A （ 4.6.1 ） 于容 量瓶 中， 用水 稀释 至刻 度， 混匀 。按表 2分别 移取 不同 体积 的标 准溶液 B （ 4.6. 2 ） 于容 量瓶 中， 用水 稀释 至刻 度， 混匀 。G B / T 22400 20082表 1
8、标准 工作 溶液 配制 （高 浓度 ）表 2 标准 工作 溶液 配制 （低 浓度 ）4.7 磷酸 盐 缓冲 液 ： 0.05 m ol / L 。称取 6.8 g 磷酸 二氢 钾 （ 4.3 ） （ 准确 至 0.01 g ） ， 加 水 800 m L 完全 溶解 后， 用 磷 酸 （ 4.2 ） 调 节 pH 至 3 .0 ，用水 稀释 至 1 L ， 用滤 膜（ 4.9 ）过 滤后 备用 。4.8 一次 性 注射 器 ： 2 m L 。4.9 滤膜 ：水 相， 0.45 m 。4.10 针 式 过滤 器： 有机 相， 0.45 m 。4.11 具塞 刻度 试管 ： 50 m L 。5 仪
9、器5.1 液相 色谱 仪： 配有 紫外 检测 器 / 二极 管阵 列检 测器 。5.2 分析 天平 ：感量 0. 000 1 g 和 0.01 g 。5.3 pH 计： 测量 精度 0.02 。5.4 溶剂 过滤 器。6 测定 步骤6.1 试样 的制 备称取 混合 均匀 的 15 g 原料 乳样 品 （ 准确 至 0.01 g ） ， 置 于 50 m L 具塞 刻度 试 管 （ 4.11 ） 中， 加 入 30 m L乙腈 （ 4.1 ） ， 剧烈 振荡 6 m i n ，加水定容至 满刻度 ， 充分混匀后 静置 3 m i n ， 用 一次性 注射器 （ 4.8 ）吸取 上清 液用 针 式
10、 过滤 器 （ 4.10 ） 过滤 后， 作为 高效 液相 色谱 分析 用试 样。6.2 高效 液相 色谱 测定6.2.1 色谱 条件a ) 色谱 柱： 强阳 离子 交换 色谱 柱 ， S C X ， 25 0 m m 4.6 m m （ i .d. ）， 5 m ，或 性能 相当 者 。注： 宜 在色谱柱前加保护柱 （ 或预柱 ） ， 以 延长色谱柱 使用 寿命。b) 流动 相 ：磷 酸盐 缓冲 溶液 （ 4.7 ） - 乙腈 （ 70+ 30 ，体 积比 ）， 混匀 。c ) 流速 ： 1.5 m L / m i n 。d) 柱温 ：室 温。e ) 检测 波长 ： 240 nm 。f )
11、进样 量： 20 L 。6.2.2 液相 色谱 分析 测定6.2.2.1 仪器 的准 备开机 ，用 流动 相 平衡 色谱 柱， 待基 线稳 定后 开始 进样 。6.2.2.2 定性 分析标准溶液 A 体积 （ m L ） 0 . 1 0 0 . 2 5 1 . 0 0 1 . 2 5 5 . 0 0 1 2 . 5定容体积 （ m L ） 1 0 0 1 0 0 1 0 0 5 0 . 0 5 0 . 0 5 0 . 0标准工作溶液浓度 （ m g / L ） 0 . 2 0 0 . 5 0 2 . 0 0 5 . 0 0 2 0 . 0 5 0 . 0标准溶液 B 体积 （ m L ） 1
12、. 0 0 2 . 0 0 4 . 0 0 2 0 . 0 4 0 . 0定容体积 （ m L ） 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0标准工作溶液浓度 （ m g / L ） 0 . 0 0 5 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 1 0 0 . 2 G B / T 22400 20083依据 保留 时间 一致 性进 行定 性识 别的 方法 。 根据 三聚 氰胺 标准 物质 的保 留时 间，确 定 样品 中三 聚 氰胺的 色谱 峰 （ 参见 附录 A ） 。 必要 时应 采用 其他 方法 进一 步定 性确 证。6.2.2.3 定量 分析校准 方法 为外 标法 。6.
13、2.2.3.1 校准 曲线 制作根据 检测 需要 ， 使用 标准 工作 溶液 （ 4.6.3 ） 分别 进样 ， 以 标 准工 作溶 液浓 度为 横坐 标， 以 峰 面积 为纵坐 标， 绘制 校准 曲线 。 6.2.2.3.2 试样 测定使 用 试 样 （ 6.1 ） 分别 进样 ，获 得 目标 峰面 积。根 据 校准 曲线 计算 被测 试样 中三 聚氰 胺的 含量 （ m g / kg ） 。试样 中待 测三 聚氰 胺的 响应 值均 应在 方法 线性 范围 内。 注： 当试样中三聚氰胺的响应值 超出 方法的线性范围 的上限 时， 可 减少称样量再进行提取与测定。6.2.3 结果 计算6.2.
14、3.1 计算 公式结果 按式 （ 1 ） 计算 ： （ 1 ）10001000= mVcX式中 ： X 原料 乳中 三聚 氰胺 的含 量， 单位 为毫 克每 千克 （ m g/ kg ） ；c 从 校准 曲线 得到 的三 聚氰 胺溶 液 的 浓度 ，单 位为 毫克 每升 （ m g/ L ） ；V 试样 定容 体积 ，单 位为 毫升 （ m L ） ；m 样品 称量 质量 ，单 位为 克 （ g ） 。6.2.3.2 计算 结果 有效 数字通常情况下 计算结果 保留 3 位有效数字；结果在 0.1 1.0 m g/ kg 时，保留 2 位有效数字；结果小于 0.1m g/ kg 时， 保留 1
15、 位有 效数 字。6.3 平行 试验按以 上步 骤， 对同 一样 品进 行平 行试 验测 定。6.4 空白 试验除不 称取 样品 外， 均按 上述 步骤 同时 完成 空白 试验 。6.5 方法 检测 限本方 法的 检测 限为 0.05 m g/ kg 。6.6 回收 率在添 加浓 度 0. 30 m g/ kg 100 .0 m g/ kg 范围 内， 回收 率在 9 3.0 % 103% 之间 ，相 对标 准偏 差小 于 10 % 。7 精密 度 本标 准精 密度 数据 按照 G B / T 6379.1 和 G B / T 6379.2 规定 确定 ，其 重复 性和 再现 性值 以 95%
16、 的置 信度计算 。7.1 重复 性在重 复性 条件 下， 获得 的两 次独 立测 量结 果的 绝对 差值 不超 过重 复性 限 r ，样 品中 三聚 氰胺 含量 范围及 重复 性方 程见 表 3 。如果 两次 测定 值的 差值 超过 重复 性限 r ，应 舍弃 试验 结果 并重 新完 成两 次单 个试 验的 测定 。7.2 再现 性在再 现性 的条 件下 ， 获 得 的两 次独 立测 试结 果的 绝对 差值 不超 过再 现性 限 R ， 样 品 中三 聚氰 胺的 含量范 围及 再现 性方 程见 表 3 。G B / T 22400 20084表 3 三聚 氰胺 含量 范围 及重 复性 和再
17、现性 方程7.3 重复 性与 再现 性参 考值表 4 列出 了 m 在不 同范 围时 的 r 与 R 值 ，供 参考 。表 4 m 在不 同范 围时的 r 与 R 值8 试验 报告 试验 报告 应包 括 以下 内容 ：a ) 鉴别 样品 、实 验室 和分 析日 期等 资料 ；b) 遵守 本标 准规 定的 程度 ；c ) 分析 结果 及其 表示 ；d) 测定 中观 察到 的异 常现 象；e ) 对 分析 结果 可能 有影 响而 本部 分未 包括 的操 作或 者任 选的 操作 。9 质量 保证 a ) 操作 人员 应按 照国 家相 关规 定， 并具 备从 事相 应实 验技 术的 能力 ；b) 仪器
18、 及相 关计 量器 具 应通 过检 定或 校准 ， 并 在有 效使 用期 内；c ) 宜 采用 有证 标准 物质 ，若 采用 自配 标样 ，应 使用 有证 标准 物质 对自 配标 样进 行验 证；d) 原料 乳样 采集 和保 存应 严格 执行 本标 准和 国家 相关 规定 ，实 施全 过程 质量 保证 。10 注意 事项 a ) 如果保 留时 间或 柱压 发生 明显 的变 化， 应检 测离 子 交换 色谱柱 的柱 效以 保证 检测 结果 的可靠性；b) 使用 不同 的离 子 交换 色谱 柱， 其保 留时 间有 较大 的差 异， 应对 色谱 条件 进行 优化 ；c ) 强阳 离子 交换 色谱 的
19、流 动相 为酸 性体 系， 每天 结束 实验 时 应以 中性 流动 相冲 洗 仪器 系统 进行 维护保 养。m （ m g / k g ） 0 . 3 0 0 . 4 0 0 . 4 0 0 . 5 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 0 0 2 . 0 0 2 . 0 0 2 . 5 0 2 . 5 0 1 0 . 0r 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 3R 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 2 0 0 . 3 4 0 . 4 0m （ m g / k g ） 1 0 . 0 2 0 . 0 2 0 .
20、 0 4 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 0 8 0 . 0 1 0 0 . 0r 0 . 4 7 0 . 8 9 1 . 6 9 2 . 4 6 3 . 2 2R 1 . 1 7 2 . 0 1 3 . 4 4 4 . 7 1 5 . 8 8成分 含量范围 （ m g / k g ） 重复性限 （ r ） 再现性限 （ R ）三聚氰胺 0 . 3 1 0 0 . 0 l g r = -1 . 2 6 0 + 0 . 9 2 8 6 l g m l g R = -0 . 7 0 4 4 + 0 . 7 7 4 4 l g m注： m 表示 两次 测定 结果 的算 术平 均值 ，单 位为 m g/ kg 。G B / T 22400 20085附 录 A（资 料性 附录 ）三聚 氰胺 参考 色谱 图图 A .1 三聚 氰胺 标准 样品 色谱 图 （浓 度 5.00 m g/ kg ）图 A .2 原料 乳中 添加 三聚 氰胺 的色 谱图 （浓 度 4.00 m g/ kg ）三聚 氰胺三聚 氰胺
