1、ICS 19020：7110040G 76 a宦中华人民共和国国家标准GBT 22595-2008杀生剂能效的评价方法 异养茵Test method for efficacy of antimicrobials-Aerobic bacteria2008-12-23发布 2009-09-0 1实施丰瞀徽鬻瓣譬糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅们1刖 置本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SACTC 63SC 5)归l。本标准负责起草单位：上海未来企业有限公司、中海油天津化工研究设计院。本标准主要起草人：刘昕、张全、
2、邵宏谦、朱传俊。GBT 22595-20081范围杀生剂能效的评价方法异养菌本标准规定了在冷却水系统中使用的杀生剂对异养菌杀灭能效的评价方法。本标准适用于氧化性及非氧化性杀生剂对异养菌的杀菌能效的评价。GBT 22595-20082规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GBT 603-一2002，ISO 63531
3、：1 982，NEQ)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 66822008，ISO 3696：1987，MOD)GBT 146431工业循环冷却水中黏液形成菌的测定平皿计数法3方法提要在含一定数量异养菌的试样中，定量的加入杀生剂，模拟杀生剂的使用条件(水质、pH值等)，在选定的时间周期测定试样中存活异养菌的数量与试验起始时异养菌的数量做比较，计算此杀生剂对异养菌的杀生率。4试剂和材料本标准所用试剂和水，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GBT 6682中三级水的规定。试验方法中所用制剂及制品，按GBT 603规定制备。41牛肉膏：生化试剂。42蛋白胨：生化试剂。43氯化钠。
4、44琼脂：生化试剂。4。5氢氧化钠溶液：40 gL。46盐酸溶液：1+l。47乙醇溶液：75(体积分数)。48牛皮纸。49镊子。410滤纸。411医用脱脂棉。412医用脱脂纱布。5仪器、设备51无菌箱(室)或超净工作台。52蒸汽压力灭菌器。53生化培养箱。】GBT 22595-200854电热干燥箱：温度控制在60280。55刻度吸管：1 mL。56刻度吸管：5 mL。57容量瓶：1 000 mL。58培养皿：柏o mm。59锥形瓶：500 mL。510搪瓷量杯：1 000 mL。511磨口锥形瓶：100 mL。512微量进样器。6试验前准备61培养基的制备611 固体培养基的制备：称取下列试
5、剂：牛肉膏30 g。蛋白胨100 g。氯化钠50 g。琼脂：根据所用琼脂的凝固力及季节的不同适当增减，一般为1 50 g200 g。将上述试剂加水约950 mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1 000 mL。用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至70o2，并分装在500 mL锥形瓶中，每瓶装量不超过其总容量的23。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(1211)灭菌15 min30 rain。612液体培养基的制备：称取下列试剂：牛肉膏30 g。蛋白胨100 g。氯化钠50 g。将上述试剂加水约950 mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层
6、医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至l 000 mL。用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至7002，并分装在500 mL锥形瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的23。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(1211)灭菌15 rain 30 rain。62试验用水的制备621将水分装在100 mL磨口锥形瓶中，塞上棉塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121士1)灭菌15 min30 rain。63刻度吸管的灭菌631将洗净并烘干后的刻度吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10 remit5 mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6
7、32每支刻度吸管用一条约40 mm50 mm宽的牛皮纸条，以45。左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于(1602)灭菌2 h。64锥形瓶的灭菌将锥形瓶的瓶口用棉塞塞紧，每个瓶子均用牛皮纸包扎以防污染，置电热干燥箱中，于(1602)灭菌2 h。2GBT 22595-200865培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于(1602)灭菌2 h。66无菌箱(室)灭菌把试验所用的无菌稀释水，无菌培养皿、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌30rain。67试
8、样的制备671试样可直接从敞开式循环水系统中采集，采集试样的循环水系统中异养菌总数在105 dumI107 cfumL范围内时，可直接使用。672采集的循环水系统中异养菌总数低于105 cfumL时，应按附录A规定进行富集培养，将循环水系统中的异养菌含量提高至105 cfumL107 cfumL范围内，得到试样。控制试样中的营养成分不能过高，以防止在杀生剂评价过程中对试验结果产生影响。7评价方法71试验杀生剂与浓度711根据杀生剂的性能结合生产工艺条件(温度、pH值、污染物、水稳配方等)选取几种相对较为合适的杀生剂进行试验。对某些杀生剂的性能尚未了解时，可按附录B规定通过抑菌圈法或最低抑菌浓度
9、法试验了解其性能。712作为高效杀生剂，在一般循环冷却水的正常处理中，杀生剂投加浓度选择范围应根据杀生剂的特性、使用条件等，在一定范围内选取几个浓度等级进行试验。713为加药操作方便，试验前应将供试杀生剂原液用试验用水做稀释处理，稀释的程度以杀生剂稀释液加入到试样中后，刚好达到试验所需要的浓度(稀释好的杀生剂的体积与要加入试样的体积比不得超过1：100)。杀生剂稀释液应现用现配。72试验步骤721一般性试验7211 本试验用于选择合适的杀生剂种类和恰当的投加浓度。7212取67中制备好的异养菌含量在105 cfumL107 cfumL的试样200 mL，加入到锥形瓶中(具体瓶数由同一批次试验的
10、杀生剂总数和浓度等级数而定)，并加棉塞。7213按GBT146431测定所取水样的异养菌存活菌数，即为同一批次试验的起始菌数。72，1，4将锥形瓶编号，每瓶对应地加入713中的杀生剂稀释液，充分摇匀。7215将全部锥形瓶置于(291)的恒温生化培养箱中培养。7216杀生剂加入后的第4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时(具体测定时间根据杀生剂的特性、使用条件等确定)测定锥形瓶中异养菌总数，即为不同时间异养菌存活菌数。7217杀生率以”计，数值以表示，按式(1)计算：一堕二100户。式中：岛起始茵数，单位以菌落数每毫升表示(cfumL)；P一存活菌数，单位以菌落数每毫升表示(cf
11、umL)。7218根据不同时间和浓度的杀菌率结果绘制某一浓度的时间一杀生率曲线和某一时间的浓度一杀生率曲线。722其他试验，可根据杀生剂的应用场所、应用条件、应用温度、pH值条件、药剂配方等条件的变化，在一般性试验的基础上做适当的条件改变，进行试验。3GBT 22595-2008附录A(规范性附录)异养菌的富集培养A1取异养菌含量低于105 cfumL的循环水样10 mL，加人到i00 mL的液体培养基中，摇匀后置(29土1)下恒温培养24 h以上。A2吸取上述培养液适量，加入异养菌含量低于105 cfumL的循环水样(一般培养液和循环水样的比例不超过1；100)。A3为了使试样中茵数控制在1
12、05 cfumL107 cfumL范围，应先做一系列的平皿计数，以找出相应的大致关系。4附录B(规范性附录)抑菌圈法和最低抑菌浓度法GBT 22595-2008B，1抑菌圈法将浸渍过不同杀生剂(根据试验的要求可以选用同一种杀生剂的不同浓度、不同的杀生剂的相同浓度等)的滤纸片放在含菌的固体培养基上，通过培养后测量滤纸片产生透明圈的直径，判断杀生剂的杀菌能效。B，11试验杀生剂与浓度根据的性能结合生产工艺条件(温度、pH值、污染物、水稳配方等)选取几种相对较为合适的杀生剂进行试验，也可选用不同杀生剂的不同浓度或同一杀生剂的不同浓度，试验前应将供试杀生剂原液用无菌蒸馏水稀释至所选择的浓度。B12培养
13、皿编号，标明所选杀生剂的名称和浓度。B13用无菌移液管向培养皿中注入68中制备的试样02 mL05 mL，再向培养皿中注入约10 mL15 mL熔化后冷至(451)左右的固体培养基，将试样和培养基充分摇匀，冷却备用。B14用无菌的镊子将直径5 mm的灭过菌的滤纸片在稀释好的待测杀生剂中浸渍片刻，取出后置于对应编号的带菌培养基平板(B13中制备的)中央，盖上培养皿盖。注1：滤纸片实验前应用紫外线灯灭菌30 rain。注2：同一杀生剂不同浓度的比较、不同杀生剂同一浓度的比较应使用同一种规格的滤纸片。B15将B14置于适宜的温度下培养一定时间(根据不同的试验条件而定)，观察滤纸圆片的周围的透明的抑菌
14、圈的有无或用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录，从而判断杀生剂杀菌能效的大小。注：抑菌圈法仅是一种能够定性或半定量的方法，而抑菌圈的大小受杀生剂在琼脂平板上的扩散能力(与杀生剂的性质、培养基的组成、培养温度都有关)影响很大，但由于这种方法操作简单、肉眼就可以辨认直观性好，因而可以对杀生剂起到一个初步筛选的作用。B2最低抑制浓度法将含菌试样接种到含有不同杀生剂(根据试验的要求可以选用一种杀生剂的不同浓度、不同的杀生荆等)的同体培养基上，在一定温度下培养一定时问(视试验要求而定)后，观察异养菌能否生长，从而判断杀生剂的杀菌能效。B21试验杀生剂与浓度根据杀生剂的性能结合生产工艺条件(温度、pH值、污染
15、物、水稳配方等)选取几种相对较为合适的杀生剂进行试验。也可根据杀生剂的特性在一定范围内选取几个浓度等级进行试验。B22制备不同浓度的杀生剂溶液将杀生剂原液用试验用水做稀释处理，稀释的程度使得杀生剂稀释液加入定量的培养基后，刚好达到试验所需要的浓度。B23培养皿编号，标明所选杀生剂的名称和浓度。B24用无菌移液管移取B22中的杀生剂稀释液1 mL，加入到对应编号的培养皿中，并立即在培养皿中定量注入冷却至(451)灭过菌的培养基10 mL15 mL，充分摇匀，冷却备用。B25用微量进样器取10 uL的67的试样，然后置于含杀生剂的培养基平板(B24中制备的)中5GBT 225952008央，盖上培养皿盖。B26将B25置于适宜的温度下培养一定时间(根据不同的试验条件而定)，根据试样在含杀生剂平板生长情况，确定杀生剂对试样的最低抑菌浓度，从而判断杀生剂杀菌能效的大小。注：最低抑菌浓度法是一种定量方法，它能比较好的反映出杀生剂的杀菌能效的大小，便于不同杀生剂之间抑菌效果的比较，然而，不同来源的测定数据常常存在差异，有的差异比较大，甚至同一个实验室不同批次的试验这种差异也难以避免。6
