1、ICS 71.040.40;13.060.70 G 76 G冒中华人民圭七J卢飞、和国国家标准GB/T 26322-2010 工业循环冷却水中亚硝化菌的测定MPN法Examination of nitrite bacteria in industrial circulating cooling water-MPN test 2011-01-04发布2011-12-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 26322-2010 目lJr:I 本标准按照GB/T1. 1 2009给出的规则起草。本标准由中国石油和化学工业联合会提出。本标准由全国化学
2、标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC63/SC 5)归口。本标准负责起草单位:中海油天津化工研究设计院、广州市特种承压设备检测研究院。本标准主要起草人:张全、李琳、黎华、滕厚开、杜玉辉。I GB/T 26322-2010 1 范围工业循环冷却水中亚硝化菌的测定MPNj去本标准规定了工业循环冷却水中亚硝化菌的测定方法。本标准适用于工业循环冷却水中亚础化商的测定，也适用于原水、生活用水及蒙古泥中亚硝化菌的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T
3、 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T603- 2002 , ISO 6353-1; 1982 , NEQ) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682- 2008 , ISO 3696 :1 987 , MOD) 3 方法提要在28oc 30 oc下，恒温培养试样14d后，先采用格里斯氏(Griess)试剂定性判断亚硝化商的存在。如果溶液呈红色，表明为阳性反应;如果溶液未呈红色，表明为阴性反应。再采用MPN技术对被测试样中的亚硝化菌进行计数。4 试剂和材料4. 1 本标准所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。
4、试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。4.2 硫酸镣。4.3 碳酸钙。4.4 磷酸二氢铀。4.5 磷酸氢二何。4.6 硫酸钮(MnS04 4Hz 0)。4. 7 硫酸镜(MgS04 7Hz 0)。4.8 对氨基苯磺酸。4.9 -茶股。4. 10 盐酸溶液:1十1104. 11 乙酸溶液(10%)。4.12 氢氧化铀溶液:40g/L。4.13 乙醇溶液:体积分数为75%。4. 14 牛皮纸。1 GB/T 26322-2010 4.15 医用脱脂纱布。4. 16 医用脱脂棉。5 仪器、设备5. 1 无菌箱(室)或超净工作台。5.2 蒸汽压力灭菌器。5.3 生化培
5、养箱。5.4 电热干燥箱:温度可控制在60.C c280 .C。5.5 刻度吸管:1mL。5.6 刻度吸管:10mLo 5. 7 试管:d20mmX200 mmo 5.8 试管架。5. 9 磨口试剂瓶:1 000 mLo 5.10 容量瓶:1000 mL。5. 11 搪瓷量杯:1 0)0 mL。5. 12 白色比色瓷板。6 试验前准备6.1 无菌稀释水的制备6. 1. 1 生理盐水的配制:称J&8. 5 g氧化铀，前解在1()(1 0 mLJj(rl，泪匀。6. 1. 2 将生理盐水分装在d20mm X 200 mm的试管中，每霄;:)mL，塞上棉塞，用牛皮纸把试霄口包好，用蒸汽压力灭商器-f
6、021士1).C灭的15rnin30 min。6.2 富集培养基的制备称取下列试剂:硫酸镀(NH4 )ZS04 磷酸二氢铀NaHzP04 2.0 g , 0.25 g, 磷酸氢二饵KzHPO夺0.75 g, 碳酸钙CaC03 5.0 g; 硫酸钮MnS04.4HzO 0.01 g, 硫酸镶MgS04 7Hz 0 0.03 g. 将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中。用热水补充至1000 mL，用氢氧化铀溶液调节pH值至7.07. 2，并分装在此ommX200 mm的试管中，每管10mL，塞上棉塞，用牛皮纸把管口包好。十个一捆，用蒸汽压力灭菌器于
7、(121土l).C灭菌15 min30 min。6.3 指示剂的制备格里斯氏(Griess)试剂A液:对氨基苯磺酸0.5g，乙酸溶液(10%)150mL，保存在棕色瓶中。B液:-荼胶0.1g，水20mL，乙酸溶液(10%)150mL，保存在棕色瓶中。2 G/T 26322-2010 6. 4 J度眼管的灭茵6.4. 1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm15 mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.4.2 每支刻度吸管用一条约40mm50 mm宽的牛皮纸条，以150左右螺旋形卷起来，吸管的尖部在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度
8、，若干支扎成4束，置电热干煤箱中，号-060:1:2)C灭菌2h , 6.5 采样瓶的灭菌将洗净并烘干后的1000 mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好，扎紧，置电热干燥箱中，于(160士2)C灭菌2h。7 测定步骤7. 1 将待测试样放入无菌箱(室)1 J ，立即用体积分数为75%的乙邸溶液浸泡的医用脱脂棉球擦于，111燃元商箱(室)内的酒精灯。试样的稀释和接示l操作应在兀肉和(主)内的火焰民进行。7.2 用10倍稀释法稀释试样。UIlJjj1 mLX菌刻度吸管吸取1川L待测试样注入到9mL元南稀释水管中，充分摇匀，此时稀释度为101 0 7.3 另取一支1mL元菌刻度吸Tt吸取1r川J稀释
9、庭为10-1的试怦移到第二个元前稀释水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，以此类推，直至需要的稀释度为止。7.4 将水样(包括稀释水样分别挂种子装有培养萃的试管中，民忏置试特架上，每个稀释度重复接利15管(也可根据需要重复接种3管或4管)，每管接利11 mL，4u接种-个稀释度更换一支元菌吸管。7.5 另取一组试管培养基不接水样，作为空白。7.6 培养:在生化培养箱中于28C 30 C恒温培养11d o 8 计数与报告8. 1 取出少量培养液(约5滴)于白色比色瓷板小窝中，依次加入格里斯民(Griess)试剂A液和B液各两滴(格里斯氏试剂A液和B液应按顺序加入)。如果溶液呈红色，则表示有亚硝
10、化菌存在，以十(阳性)表示;如果溶液未呈红色，则表示无亚硝化菌存在，以一(阴性)表示。8.2 如果空白出现阳性反应，说明测定过程中有污染，本次测定无效。8.3 计算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。8.4 在10进位稀释中多于3个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的3个稀释度，对这3个稀释度的选择原则是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的2个更高的稀释度，计算出阳性组合指数(见表1中示例1、示例2、示例的。8.5 若按照8.4规定的原则选出3个稀释度后，有更高的稀释仍然产生1个阳性试管，就应将这一阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1中示例
11、3)。8.6 根据阳性组合的指数，查附录A中表儿1得出最大可能菌数(MPN)除以阳性组合指数的第，位数字的稀释度数，即为每毫升水样中亚硝化菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或者3管，根据阳性组合的指数查附录B中表B.1或附录C中表C.l)。3 G/T 26322-2010 表1稀释度、生长情况及阳性试管数报告方式示例阳性组合指数个/mL100 10-1 10- 10-3 10-4 十十+十+十十一一一一一1 520 5.0/10-1 = 50 5 5 2 。十十十十十十+十+一十十一一一一一一一一一一2 512 25/100 = 25 5 4 2 。十十十十十十+一十一一十一一一一一一一一3
12、 532 14/100 = 14 5 3 1 1 。+十十十十十+十十十十+ 一一一一一一一一3.5/10- = 4 510 5 5 5 l 。3.5X10 9 精密度9. 1 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实现，精密度表达仅能按MPN程序。9.2 在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上，MPN正确度随着平行管的增加而增加，当使用5个平行管时，每管加1mL样品时测定结果的置信度为95%。4 GB/T 26322-2010 附录A(规范性附录)五个平行管最大可能的菌数表A.l规定了五个平行管最大可能的菌数。表A.1指数个/mL指数个/mL指数个/mL指数个/mL000
13、0.0 203 1. 2 400 1. 3 513 8. 5 001 0.2 210 o. 7 401 1. 7 520 5. 0 002 0.4 211 o. 9 402 2.0 521 7.0 010 o. 2 212 1. 2 403 2. 5 522 9.5 -一唱一一一一二一一011 0.4 220 0.9 410 1. 7 523 二二-一一一一一一012 0.6 221 1. 2 411 2.0 524 -一一一一二020 0.4 222 1. 4 412 2.5 525 -一-021 o. 6 230 1. 2 420 2.0 530 8.0 030 o. 6 231 1. 4
14、 421 2.5 531 11. 0 100 0.2 240 1. 4 422 3.0 532 14.0 卜-一一一一101 o. 4 300 0.8 430 2.5 533 17.0 102 0.6 301 1. 1 431 3.0 534 20.0 103 0.8 302 1. 4 432 4.0 535 25.0 110 0.4 310 1. 1 440 3.5 540 13.0 111 0.6 311 1. 4 441 4.9 541 17.0 112 0.8 312 1. 7 450 4.0 542 25.0 120 O. 6 313 2.0 451 4.0 543 30.0 121
15、 0.8 320 1. 4 500 2.5 544 35.0 122 1. 0 321 1. 7 501 3.0 545 45.0 130 0.8 322 2.0 502 4.0 550 25.0 131 1. 0 330 1. 7 503 6.0 551 35.0 141 1. 1 331 2.0 504 7.5 552 60.0 200 O. 5 340 2.0 510 3.5 553 90.0 201 O. 7 341 2. 5 511 4.5 554 160.0 202 O. 9 350 2. 5 512 6.0 555 180.0 5 GB/T 26322-2010 附录B(规范性附
16、录)四个平行管最大可能的菌数表B.l规定了四个平行管最大可能的菌数。表B.1 指数个/mL指数个/mL指数个/mL指数个/mL000 0.0 113 1. 3 23 2.0 102 5.0 001 0.2 120 0.8 240 2.0 403 7.0 002 0.5 21 1. 1 241 3. 0 410 3. 5 003 0.7 122 1. 3 300 1. 1 111 5. 5 010 0.2 123 1. 6 301 1. 6 412 8.0 011 O. 5 130 1. 1 302 2.0 413 11. 0 012 0.7 131 1. 4 303 2.5 414 14.0
17、013 O. 9 132 1. 6 310 1. 6 420 6.0 020 O. 5 140 1. 4 311 2.0 121 9.5 021 O. 7 141 1. 7 312 3. 0 422 13.0 022 0.9 200 0.6 313 3.5 423 17.0 030 O. 7 201 0.9 320 2.0 424 20.0 031 O. 9 202 1. 2 321 3.0 430 11. 5 040 O. 9 203 1. 6 322 3.5 431 16.5 04 1. 2 210 0.9 330 3.0 432 20.0 100 0.3 211 1. 3 33 3. 5
18、 433 30. 0 0 O. 5 212 1. 6 332 4.0 434 35.0 102 0.8 213 2.0 333 5.0 440 25.0 03 1. 0 220 1. 3 340 3.5 441 40. 0 110 O. 5 221 1. 6 341 4.5 442 70.0 111 0.8 222 2.0 400 2.5 443 140.0 112 1. 0 230 1. 7 401 3. 5 444 160.0 6 G/T 26322-2010 附录C(规范性附录)三个平行管最大可能的菌数表C.l规定了三个平行管最大可能的商数。表C.1 指数个/mL指数个/mL指数个/mL
19、000 0.0 201 1. 4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5一-一一一-一一一一一一二二+一一一一一010 0.3 20 1. 5 311 011 O. 6 2 2. 0 312 1. 5 -一二一一一一一-一一一一-一020 0.6 212 3. 0 313 一-一一.100 0.4 220 2. 0 320 9. 5 101 O. 7 22 3.0 321 15.0 二十一一一一一一一一02 1. 222 3. 5 322 20.0 110 O. 7 223 4.0 323 30.0 -一一一一一一一一一一-一111 1. 230 3.0 330 25.
20、0 120 1. 231 3.5 331 45.0 121 1. 5 232 4.0 332 110.0 130 1. 6 300 2. 5 333 140.0 200 0.9 301 4.0 OFQN|NNSNH筒。华人民共和国家标准工业循环冷却水中亚硝化菌的测定MPN法国巾lGB/T 26322- - 2010 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 9导网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销唔印张0.75字数14千字2011年4月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年4月第一版等16.00 7G 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价-H号:155066.卜42019G8/T 26322-2010 打印H期:2011年5月4日F002A
