1、ICS 11. 020 C 05 gB 中华人民共和国国家标准G/T 26347-2010 蚊虫抗药性检测方法生物测定法Test methods of mosquito resistance to insecticides-Bioassay methods 2011-01-14发布数码防伪中华人民共和国卫生部岱士中国国家标准化管理委员会&叩2011-05-01实施目。吕本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。GB/T 26347-2010 本标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京疾病预防控制中心。本标
2、准主要起草人:赵彤言、汪中明、董言德、曾晓页、高希武、宋锋林、佟颖、韩玉华。I GB/T 26347-2010 蚊虫抗药性检测方法生物测定法1 范围本标准规定了测定蚊虫对有机磷类、氨基甲酸醋类、拟除虫菊醋类等杀虫药剂抗药性的诊断剂量法和敏感基线法。本标准适用于淡色库蚊CCulex户ipienspallens)、致倦库蚊CCx.ipiensquinquefasciatus)、白纹伊蚊CAedesalboictus)、中华按蚊CAnohelessinensis)等蚊虫抗药性的生物测定。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 敏感基线susceptible baseline data 所
3、测蚊虫的敏感品系对某种杀虫剂的毒力回归线CLD-p)。2.2 诊断剂量diagnostic dose 由敏感品系的敏感基线计算得到的与死亡率99%或99.9%相对应的杀虫药剂剂量值CLC99或LC99.9) ，一般以2倍LC99或LC川值区别抗性和敏感种群。2.3 F1代F1 generation 采集的样本繁殖后的第一代蚊虫。3 试虫样本多点采集。幼虫浸渍法采用F1代四龄幼虫。成蚊接触筒法采用野外采集的幼虫或蜗羽化后，3d5 d未吸血雌蚊。4 试剂丙酣、乙醋、白油、杀虫剂原药等。5 仪器蚊笼、滤纸、接触筒(参见附录A)、吸蚊器。6 测试条件温度:25oC土1oC，光周期:14L: 10 D，
4、相对湿度:60%80%。1 G/T 26347-2010 7 敏感基结法7.1 原理依据杀虫剂应用剂量和死亡机率值关系建立毒力回归方程，以敏感品系得到的杀虫剂毒力回归线作为敏感基线。以待测昆虫种群得到的杀虫剂毒力回归线与敏感基线对比，来确定待测种群的抗性水平。具体是比较两条毒力回归线的b值变化以及由毒力回归线计算得到的半数致死量的变化。7.2 操作步骤7.2.1 幼虫浸渍法每只烧杯量人149mL脱氯自来水。将待测药剂用丙酣等比或等差稀释至一个系列浓度，通过预实验确定药剂的浓度系列范围，最低浓度时幼虫死亡率小于20%，最高浓度时大于80%，然后吸取1 mL已配制好的药液捕入水面上，用玻璃棒搅匀，
5、然后把另一杯中预先挑选的幼虫(30只)连同50mL 水全部注入烧杯内，什计200mL水溶液，整个实验保持在25oc士1OC，相对湿度日0%80%的泪室内，24h后检查死亡数。件个浓度重复3次以丙酬作为对照。根据每一浓度对应的死亡率，将剂量取对数、将死亡率转换为概率单位进行回归，求出LCso值。7.2.2 成蚊接触法用白油与乙酷按1: 2的配比混合物将待测药剂等比或等差稀释至一个系列浓度，通过预实验确定药剂的浓度系列范围，最低浓度时幼虫死亡率小了:20%，最高浓度时大于80%，取2mL每个浓度的药液均匀涂抹于15.7cmX 12.5 cm大小的1mm厚的滤纸上，待榕剂挥发大约5h后，衬垫于圆筒内
6、壁，做为接触筒，用吸蚊管吸取30只羽化后3d5 d未吸血雌蚊.放入接触筒内，关闭隔板，开始计算接触时间，接触1h后抽开隔板，将蚊虫吹入恢复筒内，取下恢复筒，庄立放置，用一浸有8%葡萄糖水的棉花团置于隔板上的小孔内，24h后记录试虫死亡数。每个药剂浓度重复3次。以自油与乙酷的混合物作为对照。根据每一撒度对应的死亡率，将剂量取对数、将死亡率转换为概率单位进行回归，求出LCso值。7.3 死亡判断7.3.1 幼虫浸渍法轻轻触动幼虫，以不能逃避剌激视为死亡。7.3.2 成蚊接触法试虫完全不动视为死亡。7.4 结果表述结果用抗性倍数表述，抗性倍数=待测种群LCso值/敏感种群LCs。值。7.5 判别标准
7、敏感品系和所测样本之间95%置信限不重叠，且抗性倍数二三5倍为抗性种群。2 GB/T 26347-2010 8 诊断剂量法8. 1 原理依据杀虫剂对敏感品系的毒力回归线，确定一个能够区分敏感个体和抗性个体或抗性杂合子的剂量。一般用2倍敏感品系的LCgg值作为诊断剂量。根据待检测蚊虫种群在诊断剂量下的死亡率作为抗性判定标准。8.2 操作步骤8.2.1 幼虫浸渍法取1mL己配制好的药液加入盛有149mL脱刽自来水的烧杯中，用玻璃棒搅匀。把另一杯中预先挑选好的30条幼虫连同50mL水，全部注入上述烧杯内，合计200mL溶液，使药剂的终浓度达到诊断剂量(常用杀虫药剂对淡色库蚊幼虫的诊断剂量参见表B.l
8、)。以1mL相应溶剂处理为对照组。24 h后记录死亡数b实验重复3次。8.2.2 成蚊接触法药剂用白油与乙醒混合物(配比1: 2)稀释至诊断剂量浓度(常用杀虫剂对成蚊的诊断剂量参见表B.2和表B.3)，取2mL药液均匀涂抹于15.7 = X 12. 5 crn大小的1mm厚的滤纸，待溶剂挥发5h 后，将滤纸衬垫于接触筒内壁，用吸蚊管吸取30只羽化Jf3 d5 d未吸血l雄蚊，放人接触筒内，关闭隔板，开始计算接触时间，接触1h后抽开隔板，将蚊虫吹入恢复筒内.取F恢复筒，直立放置，用浸有8%葡萄糖水的棉花团置于纱网上，24h后记录试虫死亡数。实验噎复3伙，以f1前jJ与乙酷的混合物作为对照。8.
9、3 结果表述结果用死亡率表述，见公式。)。M=吁Xl( 1 ) 式中:M一死亡率;Nm 死亡虫数EN 一试虫总数。对照死亡率小于5%元需校正;对照死亡率在5%20%之间，用Abbott公式进行校正;对照死亡率大于20%为无效测定。依据Abbott公式校正死亡率，见公式(2)。式中zMm一一校正死亡率;M，一-处理组死亡率;M，一一对照组死亡率。8.4 判别标准M,-M, M_=一一一二X100%1-M, . ( 2 ) 在诊断剂量下蚊虫的死亡率在98%100%表明其为敏感种群;死亡率在80%97%表明其为可能抗性种群;死亡率80%表明其为抗性种群。3 GB/T 26347-2010 附录A(资
10、料性附录)世界卫生组织(WHO)推荐使用的接触筒每两个筒组成一套，一个用浸药滤纸衬垫于其内壁作为接触筒，另一个作为蚊虫接触药纸后恢复饲养的恢复筒。两个筒用有机玻璃制成，筒长12.5cm，直径5cm，一端用尼龙纱封口，另一端有几圈外螺纹。两个筒由一白色不透明的有机玻璃方隔板连接，隔板边长77cm，厚约0.5cm，中间有直径5cm的圆孔和高1cm的边圈(有内螺纹)，隔板中间装有1块活动抽板，抽板长15cm，开有直径4.5cm的圆孔，拉动抽板可使隔板两侧的圆筒封闭或打通。参照示意图见图A.1o4 恢复筒o I 纱网125 注1:图中尺寸单位为mm，材料为钢化有机玻璃。J止125 纱网o LC 注2:
11、主要做法:接触简和恢复筒一端为1mm钢丝纱网，一端与隔板相连接，通过内外丝与筒连接;抽板夹在隔板中间。抽板高150mm，宽60mm，下部预留直径45mm、15mm回孔。图A.1成蚊接触筒示意图GB/T 26347-2010 附录B(资料性附录)常用杀虫剂对蚊虫的诊断剂量B. 1 表B.l给出了常用杀虫剂对淡色库蚊幼虫的诊断剂量。表B.l常用杀虫剂对淡色库蚊幼虫的诊断剂量杀虫剂LC50/(g/L) LC90/(g/L) 诊断剂盐/(g/L)残杀威1. 15X10 1. 80 X 10- 5.00X10 辛硫磷6.00X10-6 4. 30X 10-5 5.00X10- 主4菊酶3. 9X 10-
12、6 8.50X10 4.00X10-5 高效氯A菊酶7.96X10-7 2.33 X 10-6 1. 00 X 10-5 丙烯菊醋4.98X10-5 7.17X10 2.00X10- 澳氨菊酶4.87X10斗1. 38X10-6 3.00X10-6 注:敏感品系来自军事医学科学院微生物流行病研究所蚊虫养殖室淡色库蚊北京株，测定时间为2003年3月。B. 2 表B.2给出了常用杀虫剂对淡色库蚊成虫的诊断剂量。表B.2常用杀虫剂对淡色库蚊成蚊的诊断剂量杀虫剂LC50 /(g/L) LC90 /(g/L) b土SE诊断剂量/(g/L)敌敌畏0.11 0.78 1. 51士0.207.7 残杀威0.0
13、46 O. 328 1. 49土0.223.3 二氯苯谜菊酣0.18 0.28 6.97土1.04 O. 79 高效主4名t菊陷0.008 9 0.038 2.04士0.400.25 漠A菊黯0.004 7 0.023 6 1. 83 :1: 0.22 0.2 注:敏感品系来自军事医学科学院微生物流行病研究所蚊虫养殖室淡色库蚊北京株，测定时间为2005年3月。B.3 表B.3给出了WHO推荐几种杀虫剂对按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊成蚊的诊断剂量。表B.3WHO推荐几种杀虫剂对按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊成蚊的诊断剂量(接触1h)单位为g/L杀虫剂按蚊s埃及伊蚊致倦库蚊DDT 40.0 40b 40.0
14、 杀螺硫磷10.0d 10.0 马拉硫磷50.0 8.0 50.0 恶虫威1. 0 残杀威1. 0 1. 0 1. 0 氟级2元菊醋1. 5 澳缸菊酶0.5 0.25 5 G/T 26347-2010 表B.3 (续)单位为g/L杀虫剂按蚊a埃及伊蚊致倦库蚊磁菊酶5.0 高效氯氟低菊酶0.50 O. 3 0.25 二氯苯隧菊醋7.5 2.5 2. 5 a我国主要是中华按蚊、嗜人按蚊、大劣按蚊和微小按蚊。b接触30min。c接触时间4h. d Anoheles sacharovi的接触时间2h. e接触时间2h。6 OFON|h寸的NH益。人民共和国家标准蚊虫抗药性检测方法生物测定法GB/T 26347-2010 国华白* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数12千字2011年4月第一次印刷开本880X12301/16 2011年4月第一版* i号:155066. 1-42178 16.007巳如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价GB/T 26347-2010 打印日期:2011年5月4日F002A
