1、ICS 65. 120 B 46 GB 中华人民圭t/、不H国国家标准GB/T 26427-2010 饲料中蜡样芽抱杆菌的检测Method for determination of Bacillus cereus in feeds CISO 7932: 2004 , Microbiology of food and animal feeding stuffs一Horizontal method for the enumeration of presumptive Bcillus cereus一Colony-count technique at 30 oC ,MOD) 2011-01-14发布数
2、码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-07-01实施发布中华人民共和国国家标准饲料中蜡样芽子包杆菌的栓测GB/T 26427-2010 唔中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销唔开本880X12301/16 印张1字数25千字2011年5月第一版2011年5月第一次印刷导书号:155066. 1-42015定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 26427-2010
3、 目lJ 本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准使用重新起草法修改采用IS07932: 2004(食品和动物饲料的微生物学推定蜡样芽抱杆菌计数的水平方法300C时菌落计数技术)(英文版)。本标准与IS07932: 2004相比在结构上有较多调整，附录B中列出了本标准与IS07932: 2004的章条编号对照一览表。本标准与IS07932: 2004相比存在技术性差异，这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线(I )进行了标识，附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改:删除了IS07937: 2004的目次;删除了IS07937:
4、 2004的引言;删除了IS07937: 2004的参考文献;增加了蜡样芽抱杆菌的鉴定技术。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SACjTC76)归口。本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心。本标准主要起草人:朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、张鲜妓、陈远良。I GB/T 26427-2010 饲料中蜡样芽抱杆菌的检测1 范围本标准规定了饲料中蜡样芽抱杆菌的检验方法。本标准适用于饲料中蜡样芽抱杆菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 8170 数值
5、修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699. 1饲料采样(GB/T14699.1 2005 , ISO 6497: 2002 , IDT) GB/T 20195动物饲料试样的制备(GB/T20195-2006 , ISO 6498 :1 998 , IDT) SN/T 1538. 2-2007培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南(SN/T1538. 2 2007 ,ISO/TS 11133-2 :2003 ,MOD) 3 术语和定义3.1 蜡样芽子包杆菌Bacillus cereus 在选择性培养基上能形成典型菌落，并经本标准指定的方法确证为阳性的细菌。4 原理4. 1 在选
6、择性固体培养基平板表面涂布特定量的待测液体样品或特定量的其他类型待测样品的初始悬液。在相同的条件下制备待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。4.2 平板30.C培养18h48 h。4.3 典型菌落的数量用确证试验证实，计算每毫升或每克试样中蜡样芽抱杆菌菌数。5 稀释液、培养基及试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馆水或去离子水，或相当纯度的水。5. 1 蛋白陈生理盐水稀释液:参见附录A中的A.1。5.2 甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基:参见附录A中的A.2。5.3 羊血琼脂:参见附录A中的A.3o5.4 革兰氏染色液:参见附录A中的A.4.5.5 动力培养
7、基:参见附录A中的A.5。5.6 甲醇。1 GB/T 26427-2010 15.7 0.5%碱性复红染色液:参见附录A中的A.6。6 设备和玻璃器皿需配备微生物学常规设备和以下设备。6. 1 干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。6.2 干燥箱或培养箱:对流通风，能调节温度至37.C土1.C到55.C土1.C。6.3 恒温培养箱:30.C士1.C。6.4 水浴锅:44.C47 .C可调。6.5 pH计:25.C最小检测单位为0.01，精度到土0.1个单位。6.6 玻璃或塑料培养皿:直径9cm10 cm，如必要需直径14cm. 6. 7 刻度吸管:标记容量为1mL和10mL，最小刻度分别为0.1mL和
8、0.5mL。16.8 玻璃或塑料涂布棒。6.9 显微镜。7 采样实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699. 1执行。8 试样的制备按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。9 操作步骤9. 1 检样制备、初始悬液和十倍稀释以元菌操作称取试样25g(mL)加入225mL蛋白陈生理盐水稀释液，均质1min2 min，制成1 : 10的初始悬液。吸取1: 10的稀释液1mL，加入9mL蛋白陈生理盐水稀释液，经充分混匀后制成1 : 100的稀释液。更高稀释度可按此方
9、法操作。9.2 接种和培养9.2. 1 用元菌移液管分别吸取0.1mL初始悬液(若样品本身为液体，则直接吸取样液)接种到两个甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂平板(5.2)上。采用同样操作步骤进行1: 100的稀释物的接种和培养，必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。9.2.2 对含蜡样芽抱杆菌数低于15个的样品，接种1mL的初始悬液于140mm直径的平皿，或分别接种0.3mL、0.3mL、0.4mL于3个90mm直径的平皿，使用无菌涂布棒涂布，可以达到10CFU/g 的检测下限。每种方法各做一平行，需要140mm直径的2个大平皿(或90mm直径的6个小平皿)。9.2.3 使用
10、涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个平皿用一支元菌涂布棒。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。9.2.4 翻转上述平皿置30.C培养箱中培养18h24 h。如菌落较小或无菌落生长，或未见典型菌落，可延长培养24h土3h。G/T 26427-2010 9.3 菌落计数培养后，选择长有150个菌落以下的平板，最好是两个连续稀释度的平板。计数每皿中典型的蜡样芽抱杆菌菌落数。典型蜡样芽抱杆菌菌落大，粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有晕圈(表示产生卵磷脂酶)。注，:如果平板上含有较多的可以发酵甘露醇的微生物，会导致大量产酸，蜡样芽抱杆菌典型
11、的粉红色将减弱或完全消失。注2:部分蜡样芽抱杆菌产生很少或不产生卵磷脂酶，这些菌株的菌落周围将不会有晕圈。这些菌落也应该进行确证试验。如果1.0 mL接种液涂布在3个平皿上(9.2.2)，相当于1个平板计数和进行确证试验。9.4 确证试验9.4.1 菌落挑选和纯化挑选计数平板上的5个可疑菌落进行确证。如果平板上的可疑菌落数少于5个，挑选平板上所有可疑菌落进行确证。若平板表面出现过度生长不可能选出良好分离的特征菌落时，应将5个特征菌落划线在甘露醇卵黄多粘菌素CMYP)琼脂平板上，30.C培养18h24 h。从每一平板中选取至少1个良好分离的粉红色菌落，进行确证试验。9.4.2 羊血琼脂上的溶血试
12、验挑选纯化的菌落划线、穿刺或点接在羊血琼脂(5.3)表面，30.C培养24h士2h，观察溶血反应。蜡样芽抱杆菌菌落周围呈现溶血环。9.4.3 形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(5.4)镜检。蜡样芽抱杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽抱呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。9.4.4 动力试验用接种针挑取选出的菌落穿刺接种于动力培养基(5.5)中，30.C培养24h:!: 2 h。蜡样芽抱杆菌有动力，沿穿剌线呈扩散生长。9.4.5 蛋白质结晶毒素试验取经30.C培养24h士2h并于室温放置2d3 d的培养物少许于载玻片上，滴加蒸锢水混涂成薄膜。待自然干燥后用弱火焰固定。于涂膜处加甲
13、醇，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥。然后滴加0.5%碱性复红染色液(5.7)，置火焰上加热至微见蒸汽(勿使染液沸腾)后维持1.5 min，移去火焰，将载玻片放置0.5min，倾去染液。用洁净自来水彻底漂洗、晾干、镜检。在油镜下观察有元游离芽抱和深染的似菱形的小结晶体(如游离芽抱形成得不丰富，应将培养物置室温1d2 d再行检查)。蜡样芽抱杆菌应为阴性，元深染的似菱形的小结晶体。9.4.6 试验结果试验结果见表1.3 G/T 26427-2010 表1试验结果试验确证为蜡样芽抱杆菌的试验结果MYP琼脂(9.4.1)形成粉红色菌落，周围有晕圈溶血试验(9.4.2)阳性a形态观察(9.4.3)革兰氏阳
14、性大杆菌，呈短链或长链，芽抱呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大动力试验(9.4.4)阳性，沿穿刺线呈扩散生长蛋白质结晶毒素试验(9.4.5) 阴性a不同菌株红血球溶解圈大小可能不同e10 结果计算与报告10. 1 每个平板中蜡样芽抱杆菌的数量每个平板中蜡样芽抱杆菌菌落数的计算见式(1): =去xC式中: 每块平板上的蜡样芽抱杆菌菌落数;b一一挑取后经证实为蜡样芽抱杆菌的南落数FA一一挑取平板上用于验证的菌落数;C一一平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例:若某板上长有30个典型商落，从中选出做确jE试验的5个菌中有4个证实为蜡样芽抱杆菌，则:=f
15、30=24 10.2 试样中蜡样芽抱杆菌数的计算方法与报告10.2. 1 通常情况下试样中蜡样芽抱杆菌菌数的计算方法与报告( 1 ) 10.2.1.1 当有两个连续稀释度平板上经确证后的蜡样芽抱杆菌菌数介于15150之间时，按式(2)计算1mL或1g试样中的蜡样芽抱杆菌菌数N:N一一一_2_旦V(nl + o. 1nz)d ( 2 ) 式中:N 样品中蜡样芽抱杆菌菌落数;L: a 所有平板经确证后的蜡样芽抱杆菌菌落数的总和;V一-平板的接种体积，单位为毫升(mL);nl一一第一个稀释度的平板数;nz一一第二个稀释度的平板数;d 一一第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。4 G
16、B/T 26427-2010 按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可记录为1.09. 9乘以10的指数事形式。报告每毫升或每克试样中蜡样芽抱杆菌数量，单位为CFU/g(mL)。示例:若第一个稀释度(10-2)经确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度(10-3)经确证后的菌落数为14和15，则:N = 168 + 215 + 14十15=工一一一一一=191 820 O. 1 X (2 + O. 1 X 2) X 10-2 报告每毫升或每克试样中含蜡样芽抱杆菌数量为1.9X105 CFU/g(mL)或190000 CFU/g(mL)。10. 2. 1. 2
17、当只有一个稀释度平板上经确证后的蜡样芽抱杆菌菌数介于15150个时，仍然按式(2)计算1mL或1g试样中的蜡样芽抱杆菌菌数。示例:如最后一稀释液(10-)经证实含蜡样芽抱杆菌菌落数分别为120和130,JjlJ: N = _llQ十!1Q_= 250 = 1; 1 00 00 O. 1 X 2 X 10- O. 000 02 - -报告每毫升或每克试样中含蜡样芽抱杆菌数量为1.2X107CFU/g(mL)或12000000CFU/g(mL)。10.2.2 经确证后的蜡样芽抱杆茵茵数低于15个的情况下的计算方法与报告10.2.2.1 仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含蜡样芽抱杆菌，且均
18、少于15仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含蜡样芽抱杆菌，且均少于15时，按式(3)计算1 mL或1g样品中的蜡样芽抱杆菌数NeD式中tNe 样品中蜡样芽抱杆菌数;Ne = .6旦-2Vd 2 两个被选择平板中经确证后的蜡样芽抱杆菌菌落数的总和zv 平板的接种体积，单位为毫升(mL);d一一稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。报告每毫升或每克试样中蜡样芽抱杆菌数量。示911: 某团体样品接种1mL初始悬液的菌落数分别为8和6，则:N= _8土_6_.= 14_ = 70 1 X 2 X 10- O. Z 报告每克试样中含蜡样芽抱杆菌数为70CFU/go 10.2.2.2
19、班体测试样品原液或其他样品的初始悬擅经确证后不含蜡样芽抱杆菌. ( 3 ) 报告每毫升或每克试样中蜡样芽抱杆菌数量小于l/d(d为液体测试样品原液或其他样品的初始悬液的稀释因子，未经稀释的液体样品d值为1)。5 GB/T 26427-2010 A.1 蛋白膜生理盐水A. 1. 1 成分酷蛋白陈氯化铀蒸锢水A. 1.2 制法1. 0g 8.5 g 附录A(资料性附录)培养基和试剂1 000 mL 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25oc时为7.0士0.20A.2 甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基A. 2.1 基础培养基A. 2. 1. 1 成分牛肉膏酷蛋白陈D-甘
20、露醇氯化铀酣红琼脂蒸馆水A. 2. 1. 2 制法1. 0g 10.0 g 10.0 g 10.0 g 0.025 g 12. 0 g 18. 0 gll 900 mL 除酣红外加热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25oc时为7.2土0.2，加入酣红，分装烧瓶，每瓶90mL,121 oc灭菌15min A.2.2 多粘菌素B溶波A. 2. 2.1 成分多粘菌素B蒸锢水A. 2. 2. 2 制法106IU 100 mL 多粘菌素B溶于蒸锢水，过滤除菌。1) 据凝胶强度而定。6 GB/T 26427-2010 A.2.3 卵黄夜取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，放于95%酒精溶液中浸泡
21、30s，风干。以元菌操作取出卵黄，放入灭菌量筒中，加入4倍体积的元菌水，转移至灭菌烧瓶中混匀。水浴440C470C加热2h , 5 oC士3oC静置18h24 h，形成沉淀。以元菌操作收集表面乳状液。此乳状液5oC士3oC放置不可超过72h。A.2.4 完全培养基A. 2. 4.1 成分基础培养基(A.2. 1) 多粘菌素B溶液(A.2. 2) 卵黄液(A.2.的A. 2. 4. 2 $lJ法90 mL 1. 0 mL 10.0 mL 灭菌的基础培养基冷却至约44oC47 oc后，加入其他溶液，混匀。水浴44oC47 oC冷却此完全培养基。A.2.5 制备琼脂平报每个灭菌平板倾注完全培养基15
22、mL20 mL，冷却凝同备用。5oC士3oC最多可保存4天。用之前，最好放置在干燥箱中37.C55 .C之间，使琼脂表面干燥。A.2.6 性能测试性能测试见SN/T1538.2-2007中的表B.1.A.3 羊血琼脂A. 3.1 基础培养基A. 3. 1. 1 成分蛋白脏、肝消化酶酵母膏氧化铀琼脂蒸情水A. 3. 1. 2 制法15.0 g 2.5 g 5.0 g 5.0 g 12. 0 g 18. 0 g2l 1 000 mL 热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.0土0.2，分装烧瓶，121.C灭菌15 min。2) 据凝胶强度而定。7 GB/T 26427一-2010
23、A. 3. 2 完全培养基A. 3. 2.1 成分基础培养基CA.3. 1) 元菌脱纤维羊血A.3.2.2 制法100 mL 5 mL7 mL 灭菌的基础培养基冷却至约440C470C后，加入元菌脱纤维羊血，混匀。每个灭菌平板至少倾注脱纤维羊血完全培养基12mL，冷却凝固备用。A.4 草兰氏染色液A. 4.1 结晶紫染色渣A. 4. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液A. 4.1.2 制法1 g 20 mL 80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。A. 4. 2 草兰氏确滚A. 4. 2.1 成分腆腆化饵蒸馆水A.4.2.2 制法1 g 2 g 300 mL 将腆与
24、腆化饵先进行混合，加入蒸锢水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL。A. 4. 3 沙黄复染渣A. 4. 3.1 成分沙黄95%乙醇蒸馆水A.4.3.2 制法0.25 g 10 mL 90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A. 4. 4 染色法将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗;滴加革兰氏腆液，作用1min，水洗;8 GB/T 26427-2010 滴加95%乙醇脱色，约30s，7洗;滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。A.5 动力培养基A. 5.1 成分膜蛋白陈酵母音葡萄糖磷酸氢二铀琼脂蒸锚水A. 5. 2 制法10.0 g 2.5
25、 g 5.0 g 2.5 g 3.5 g 1 000 mL 热溶解各成分，必要时，调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.3土0.2。分装试管，每管约5 mL, 121 .C灭菌15min。A.6 0.5%耐性复红染色液A. 6.1 成分碱性复红染料95%乙醇蒸馆水A. 6. 2 制法0.5 g 20 mL 80 mL 将碱性复红染料溶解于乙醇中，然后加蒸馆水。如有不溶物时，可用滤纸过滤或静置后取上清液备用。9 GB/T 26427-2010 附录B(资料性附录)本标准与1507932: 2004相比的结构变化情况本标准与IS07932: 2004相比在结构上有较多调整，具体章条编号对照情
26、况见表B.l。表B.1 本标准与ISO7932: 2004的章条编号对照情况本标准章条编号对应的国际标准章条编号5. 45. 7 6. 9 9. 4. 39. 4. 5 9.4.6 9.4.3 10.110.2 10.1 10.3 11 附录AA. lA. 3 5. 15. 3 A. 4A. 6 附录B附录C附录A附录B10 GB/T 26427-2010 附录C(资料性附录)本标准与自07932:2004的技术性差异及其原因表C.l给出了本标准与ISO7932: 2004的技术性差异及其原因。表c.1 本标准与自07932:2004的技术性差异及其原因本标准章条编号技术性差异原因1 删除了I
27、S07932: 2004关于食品以及食品生产和食品处根据我国国情，食品与动物饲理过程中环境样品的适用范围料分别制定标准删除了IS07932: 2004注:为了有一个切实可行的检测增加了确证试验，可以将蜡样方法，确证试验仅包括在MYP培养基上的典型菌落特征和芽抱杆菌和相近的但通常很少溶血试验。因此引入了推定这个词，因为确证试验不能1 遇到的芽抱杆菌如炭瘟芽抱杆将蜡样芽于包杆菌和相近的但通常很少遇到的芽抱杆菌如炭菌、苏云金芽抱杆菌、毁状芽抱瘟芽抱杆菌、苏云金芽抱杆菌、理状芽抱杆菌区分开。增加杆菌区分开运动性试验可以区分蜡样芽抱杆菌和炭瘟芽抱杆菌。关于规范性引用文件，本标准做了具有技术性差异的调整，
28、调整的情况集中反映在第2章规范性引用文件中，具体调整如下:删除的国际标准元对应的国删除了IS06887-1: 1999; 内标准，为便于标准使用者使删除了IS07218:1996; 用，本标准将这些内容直接列出2 一一删除了IS08261; 一用修改采用国际标准的SN/T1538.2-2007，代纳入本标准中;引用SN/T 1538.2-2007，便于标准替了IS0/TS11133-2:2003; 使用者使用中文术语一增加引用了GB/T8170; -增加引用了GB/T14699. 1; 一一增加引用了GB/T20195 只列出了培养基及试剂名称，将成分及配制方法转至附按GB/T20000. 1
29、要求，与我5 录A中国标准版式保持一致5.4-5.7 增加了革兰氏染色液、动力培养基、甲院、0.5%碱性复红本标准增加的确证试验所需染色液的试剂和培养基6.9 增加了显微镜本标准增加的确证试验所帘的仪器将IS07932: 2004中采样按照相应的国际标准执行，如7 果没有标准可按双方达成的一致意见执行，改为按照国内我国饲料采样有标准标准GB/T14699. 1执行将IS07932: 2004中试样的制备按照相应的国际标准执8 行，如果没有标准可按双方达成的一致意见执行，改为按照我国饲料试样的制备有标准国内标准GB/T20195执行EON-hN叮NVHh函。GB/T 26427-2010 表C.
30、1(续)本标准章条编号技术性差异原因9.1 将IS07932: 2004中9.1引用的IS06887-1相关内容列便于标准使用者使用出，纳入本标准中区分蜡样芽抱杆菌和相近的9. 4. 39. 4. 5 增加了确证试验z形态观察、动力试验和蛋白质结品毒素但通常很少遇到的芽抱杆菌如试验炭瘟芽抱杆菌、苏云金芽抱杆菌、n状芽抱杆菌将IS07932: 2004中10.1引用的IS07218: 19961 10 Amd.1: 便于标准使用者使用2001中相关内容列出，纳入本标准中删除IS07932:2004中10.3精密度内容，包括10.3.1实按GB/T20000. 1要求，与我验室间测定、10.3.2
31、重复性和10.3.3再现性国标准版式保持一致删除IS07932:2004中第11章检测报告要求检测报告应当注明所使用的检测方法，培养温度及其结果。还需要提及按GB/T20000. 1要求，与我在本标准中未涉及的所有操作步骤细节或所有可选步骤以及所有可能影响最终结果的细节。检测报告应当包含对完国标准版式保持一致成检测样品的所有必要的信息。按GB/T20000. 1要求，与我附录A将培养基和试剂成分及配制方法由IS07932: 2004中第5国标准版式保持一致，此内容属章转至本标准的附录A中资料性内容，宜安排在标准附录中删除IS07932: 2004中附录A(资料性附录)实验室间比按GB/T20000. 1要求，与我对试验数据国标准版式保持一致删除参考文献按GB/T20000. 1要求，与我国标准版式保持一致侵权必究书号:155066 1-42015 定价:4峰版权专有18.00 )G GB/T 26427-2010 打印日期:2011年6月1日F002A
