1、ICS 65. 120 B 46 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测Method for determination of Bacillus subtilis in feeds 2011-01-14发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-07-01实施发布目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SACjTC76)归口。本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心。本标准主要起草人:朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜妓。GB/T 26428-
2、2010 I 饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测1 范围本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检验方法。本标准适用于饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测和计数。2 规范性引用文件GB/T 26428-2010 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699. 1饲料采样(GB/T14699.1-2005 , ISO 6497:2002 , IDT) GB/T 20195 动物饲料试样的制备(GB/T20195-
3、2006 , ISO 6498:1998.IDT) 3 稀释液、培养基及试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馆水或去离子水，或相当纯度的水。3. 1 0.85 %灭菌生理盐水。3.2 营养琼脂(NA)培养基:参见附录A中的A.10 3.3 革兰氏染色液:参见附录A中的A.2。3.4 7%氯化铀生长培养基:参见附录A中的A.303.5 v-p测定培养基和试剂:参见附录A中的A.403.6 硝酸盐还原培养基和试剂:参见附录A中A.5。3. 7 D-甘露醇发酵培养基:参见附录A中的A.6。3.8 丙酸盐利用培养基:参见附录A中的A.7。4 设备和玻璃器皿除常用微生物实
4、验室设备外，其他设备和玻璃器皿如下。4. 1 恒温培养箱:37oC士1oC。4.2 pH计:精度到土0.1个单位。4.3 玻璃或塑料培养皿。4.4 刻度吸管:标记容量为1mL和10mL.最小刻度分别为0.1mL和0.5mL。4.5 玻璃或塑料涂布棒。4.6 显微镜:1 000倍。5 采样实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。GB/T 26428-2010 样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699. 1执行。6 试样的制备按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。7 操作步骤7. 1 检样制备、初
5、始悬液和十倍稀释以无菌操作称取试样25g(rnL)，加人225rnL O. 85 %灭菌生理盐水，均质1rnin 2 rnin，制成1 : 10的初始悬浮液。吸取1: 10的初始悬浮液1rnL，加入9rnL 0.85 %灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1: 100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。7.2 接种和培养选择2个3个适宜的稀释度，水浴80oC :I: 1 oC维持10rnin，用元菌移被管分别吸取0.1rnL，接种到两个营养琼脂平板(3.2)上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个平血用一支元菌除布棒。涂布好的平皿盖好，置室温
6、中放置15rnin使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置37oC土1oC培养箱中培养48h土2h。7.3 菌落计数及筛选培养后，选取菌落数在30个300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中南落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。典型枯草芽抱杆菌商落表面粗糙，不透明，不闪光，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则形，灰白色或微黄色。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。7.4 确证试验7.4.1 概述目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试
7、剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。7.4.2 菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于营养琼脂平板上，37oC士1oC培养48h士2h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。7.4.3 形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(3.3)镜检。枯草芽抱杆菌细胞应为杆状，有芽抱，芽抱椭圆形，中生或近中生，芽抱囊不明显膨大。7.4.4 生理生化确证试验将挑选纯化的菌落进行7%氧化铀生长(3.4)、v-p测定(3.5)、硝酸盐还原(3.的、b甘露醇发酵(3. 7)和丙酸盐利用(3.的试验。2 GB/T 26428-2010 7.4.5 确证结果枯草芽抱杆菌菌落表面粗糙，不透
8、明，灰白色或微黄色，细胞杆状，有芽抱，芽抱椭圆形中生或近中生，芽抱囊不明显膨大，在7%氯化铀中生长，v-p测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D甘露醇产酸，不利用丙酸盐者可判为枯草芽抱杆菌。枯草芽抱杆菌与类似芽抱杆菌的鉴别特征见表1。表1枯草芽抱杆菌与其他类似芽抱杆菌的鉴别特征枯草芽抱地衣芽抱蜡样芽抱凝结芽抱坚强芽于包项目杆菌杆菌杆菌杆菌杆菌B. subtilis B. lichenifo;mzs B. cereus B. coagula5 B. firmus 厌氧生长+ + 十v-p + + 十+ 硝酸盐还原+ + + d d 淀粉水解十+ + 十+ 明胶液化十+ + + 利丙酸盐十ND 用拧攘酸
9、盐十+ + d D-木糖+ + d 产L-阿拉伯糖+ 十d 酸D-甘露薛十+ d + 7%氯化销生长+ + d + pH5.7生长十+ + 十注:十z阳性;-:阴性叫:部分菌株为阳性;ND:未测定。8 结果计算与报告8. 1 计算每块板上枯草芽抱杆菌菌落数计数每块平板上的枯草芽抱杆菌菌落数，使用式(1)计算:a=去xC式中: 计数每块平板上的枯草芽抱杆菌菌落数;b一二挑取后经证实为枯草芽抱杆菌的菌落数;A一-挑取平板上用于验证的菌落数;C一平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例:迟缓芽抱杆菌B.lentus d + d 十十十d 巨大芽抱杆菌B.meg
10、terzum d + + ND + d d d d d 若某板上长有78个典型菌落，从中选出做确证实验的5个菌中有4个证实为枯草芽抱杆菌，则:a专X78 = 62.4 按照GB/T8170数值修约规则得a为62。短小芽抱杆菌B.umilus 十+ 十十+ + 十+ . ( 1 ) 3 GB/T 26428-2010 8.2 样品中枯草芽抱杆菌数的计算方法与报告选择两个连续稀释度平板(每个稀释度至少有一块平板，其上经确证后的枯草芽抱杆菌菌数介于30300之间)，通过式(2)计算，即为1mL或1g样品中的枯草芽抱杆菌数N:式中:N 一一样品中枯草芽抱杆菌菌数;N =_ a 一-V(nl + O.
11、1n2)d 2一一所有平板经确证后的枯草芽抱杆菌菌数的总和pV 平板的接种体积，单位为毫升(mL);nl 第一个稀释度的平板数;n2 一一第二个稀释度的平板数:d 一一第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。( 2 ) 按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的枯草芽抱杆菌菌落数记录为1.09. 9乘以10的指数幕表示。报告每毫升或每克样品的枯草芽抱杆菌估计数，单位为CFU/g(mL)。示例1:若第一个稀释度(10-3)俊确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度(10-1)经确证后的菌落数为34和55，则:N = 168 + 215 +
12、34十55= =一一一一一=2 145 450 0.1 X (2 + O. 1 X 2) X 10-3 按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中含枯草芽抱杆菌估计数为2100000CFU/g(mL)或2.1X106 CFU/g(mL)。示例2.若只有最后一稀释液。0-)经证实含枯草芽抱杆茵茵落数分别为120和130，则:N120+130-250-MM八n一一一一川、川Li 0.1 X 2 X 10- 0.000 02 -. vvv vv 按照GB/T8170数值修约规则修约，报告每克或每毫升样品中含枯草芽抱杆菌估计数为12000000CFU/g(mL) 或1.2X 10 CFU/
13、g(mLL 4 A.1 营养琼脂(NA)培养基A. 1. 1 成分蛋白陈10 g 牛肉膏3 g 氯化铀5g 琼脂16 g 蒸馆水1 000 mL A. 1.2 制法附录A(资料性附录)培养基和试剂GB/T 26428-2010 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.3土0.2.121.C灭菌30min A.2 草兰氏染色A. 2.1 结晶紫染色液A. 2. 1. 1 成分结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸接水溶液80 mL A. 2. 1. 2 制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸钱溶液混合。A.2.2 革兰氏慎液A.2.2.1 成分腆腆化饵蒸锚水
14、A. 2. 2.2 制法1 g 2 g 300 mL 将腆与腆化饵先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL。5 G/T 26428-2010 A. 2. 3 沙黄复染液A. 2. 3.1 成分沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL A. 2. 3. 2 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A.2.4 染色法将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗;滴加革兰氏腆液，作用1min，7.洗;滴加95%乙醇脱色，约30s, 7.洗;滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。A.3 7%氯化铀生长A. 3.1 成分蛋白陈牛肉
15、音氯化铀蒸馆水A.3.2 制法10 g 3 g 70 g 1 000 mL 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.4士0.2。分装试管，121 .C灭菌30min. A. 3. 3 试验方法取新鲜培养物接种于上述培养基中，36.C士1.C培养2d7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。A.4 V-P测定A. 4.1 培养基A. 4. 1. 1 成分蛋白陈葡萄糖氧化铀蒸馆水A.4. 1. 2 制法5 g 5 g 5 g 1 000 mL 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.0:1:0.2。分装试管，6 121 .C灭菌3
16、0min。A.4.2 试剂肌酸氢氧化铀A.4.3 试验方法0.3%或原粉40% GB/T 26428-2010 接种菌于上述培养基中，36.C土1.C培养2d4 d.取培养液和40%氢氧化铀等量相混。加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为阳性反应，有时需放置更长时间才出现红色反应。A.5 硝酸盐还原A. 5.1 培养基A.5. 1. 1 成分蛋白陈牛肉膏氧化铀硝酸饵蒸馆水A. 5. 1. 2 制法20 g 3 g 5 g 1 g 1 000 mL 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基p日伯在25.C时为7.4士0.20分装试管，121 .C灭菌30mino A.5.2 试剂
17、甲液:对氨基苯磺酸。.5g 10 %乙酸溶液150 mL 乙液:甲茶腊0.1 g 蒸馆水20 mL 10 %乙酸搭液150 mL 二苯胶试剂:二苯胶0.5 g 蒸馆水20 mL 浓硫酸100 mL A.5.3 试验方法接种菌于上述培养基中，36.C士1.C培养2d4 d。加入甲液和乙液各1滴，观察结果。如溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。如元红色出现，可加1滴2滴二苯胶试剂，如不呈蓝色，也为硝酸盐还原阳性，呈蓝色则为阴性。7 GB/T 26428-2010 A.6 b甘露醇发酵A. 6.1 培养基A. 6. 1. 1 成分磷酸氢二钱1 g 氯化饵0.2 g 硫酸镜0.2 g 酵母膏0.
18、2 g D-甘露醇10.0 g 0.04%澳甲酣紫15 mL 琼脂5 g 蒸馆水1000 mL A. 6. 1. 2 制法除指示剂澳甲酣紫外，其余各成分溶解于水，必要时加热。调整pH值，使灭菌后培养基pH值在25 .C时为7.0士0.2.加入指示剂澳甲酣紫，分装试管，115.C灭菌30min。A. 6. 2 试验方法挑取小量培养物接种于上述培养基中，36.C :I: 1 .C培养2d5 d。观察指示剂变黄，表示产酸，为阳性;不变或变蓝(紫)则为阴性。A.7 丙酸盐利用A. 7.1 培养基A. 7. 1. 1 成分硫酸镜.7H20磷酸氢二氨磷酸氢二饵.3H20氧化铀丙酸铀1%澳百里酣蓝水溶液琼脂
19、蒸馆水A. 7. 1. 2 制法0.2 g 1 g 1 g 5 g 2 g 10 mL 20 g 1 000 mL 以上成分除指示剂外加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.0士O.2。加入指示剂澳百里酣蓝，分装试管，121.C高压灭菌30min，摆成斜面备用。同时设不加丙酸盐的空白对照。8 GB/T 26428-2010 A. 7. 2 试验方法取新鲜培养物接种于上述培养基中，36oc士1oc培养48h，观察结果。培养基由绿色变为蓝色为阳性，培养基不变色为阴性。9 OFON!N寸NH阁。华人民共和国家标准饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测GB/T 26428-2010 国由* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰印张1字数18千字2011年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年5月第一版* 书号，155066. 1-41958定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 26428-2010 打印日期:2011年5月30日F002A
