1、ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 26436-2010 禽白血病诊断技术Diagnostic techniques for avian leukosis 2011-01-14发布中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会2011-07-01实施发布GB/T 26436-2010 目。自本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G、附录H为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SC/TC181)归口。本标准起草单位:山东农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局
2、、华南农业大学。本标准主要起草人:崔治中、孙淑红、赵鹏、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜。I GB/T 26436-2010 51 禽白血病病毒Cavianleukosis viruses; AL V)为反转录病毒科的反转录病毒属，可诱发鸡不同组织的良性和恶性肿瘤，是鸡群中除马立克氏病病毒CMDV)和禽网状内皮增生症病毒CREV)外的又一类重要的致肿瘤病毒。禽白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。随发生肿瘤的主要细胞成分不同，分别称之为不同名称的肿瘤。ALV可分为AJ10个亚群，其中仅A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关。A亚群、B亚群、C
3、亚群、D亚群、J亚群属外源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒基因组可完整地整合进感染鸡的染色体基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，因而称之为内源性病毒。此外，在一些鸡的染色体的不同部位，还可能带有一些ALV的基因组片段。E亚群ALV的致病性很低或没有致病性，不属于净化对象，但很多鸡群中包括一些无特定病原CSPF)鸡群都可能带有E亚群内源性ALV，它的感染不会给鸡群带来不良影响，但会干扰检测。目前，该病对我国养鸡业的危害很大。在国际种禽贸易中，外源性白血病病毒感染是最主要的检测对象之一。E 禽白血病诊断技术1 范围本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源
4、性ALV的检测方法。本标准适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。2 临床症状和病理变化GB/T 26436-2010 ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。淋巴样白血病是最为常见的经典型白血病肿瘤，肿瘤可见于肝、脾、法氏囊、肾、肺、性腺、心、骨髓等器官组织，肿瘤可表现为较大的结节状(块状或米粒状)，或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数量差异很大，表面平滑，切开后呈灰白色至奶醋色，但很少有坏死区。在成红细胞性白血病、成髓性细胞白血病、髓细胞白血病中，多使肝、脾、肾呈弥
5、漫性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿瘤，它最常见的特征性变化主要为肝脾肿大或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节。在一些病例中，还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节。单纯苏木精伊红染色(H.E染色)的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴样细胞肿瘤结节时，要注意与马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)诱发的肿瘤相区别;在表现为髓样细胞瘤时，既要与REV诱发的类似肿瘤细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性炎症相区别，如鸡戊型肝炎病毒感染引起的肝局部炎症。最终的鉴别诊断以肿瘤组织中的病毒抗原检测或病毒分离鉴定为最可靠依据。3 病毒的分离培养、检测和鉴定3
6、. 1 试剂和仪器3. 1. 1 试剂DMEM液体培养基(pH7.2)、0.25%膜酶、磷酸盐缓冲液(0.01mol/L PBS, pH7. 2)、抽提缓冲液、青霉素(10万U/mL)、链霉素(10万U/mL)、抗ALV单抗、抗ALV单因子鸡血清、异硫氨酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG抗体、ALV-p27抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂、RT-PCR试剂、生理盐水(0.9%氧化铀)、元水乙醇(分析纯)、丙酣(分析纯)、甘油(分析纯)、75%酒精、腆酒、细胞生长液(含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、细胞维持液(含有1%胎牛血清或小
7、牛血清的DMEM液体培养基)、大肠杆菌(TG1)、蛋白酶K、70%冷乙醇、乙酸铀(分析纯)、三氯甲烧(分析纯)、异戊醇(分析纯)、异丙醇(分析纯)、10X加样缓冲液、琼脂糖、DL2000DNA Marker、TAE电泳缓冲液、氧化钙(0.1 mol/L)、氨韦青霉素(100问/L)、双蒸水、LB液体培养基、TE缓冲液、RNase、细胞裂解液、0.1%的DEPC(焦碳酸乙二醋)水等(除特殊说明外，上述试剂均为分析纯)。3.1.2 仪器锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱，冰冻台式离心机(注12000 r/min)、-20.C冰箱、-80.C冰箱、GB/T 26436-2010 Eppendorf管(离
8、心管)、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平皿、37.C数显恒温水浴锅、37.C摇床、96孔培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽(16.C)、吸水纸。3.2 分离病毒用细胞3.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A。3.2.2 鸡胚成纤维细胞自发永生株(DF1)细胞DF1细胞培养基制备方法见附录B。3.3 病料的采集与处理3.3. 1 全血、血清或血浆取疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清，元菌接种于长成单层的CEF或DF1，置于含5%二氧化碳的37.C恒温培养箱中培养。3.3.2 脏器采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏，按脏器质量的l倍2倍
9、加入灭菌生理盐水(含青霉素和链霉素各1000 IU/mL)研磨，直至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后，4.C , 10 000 r/min离心5 min，收集上清液。按3.4.l. 1中的方法接种培养或一70.C保存备用。3.3.3 瘟苗样晶疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，应接种DF1细胞或其他抗E亚群白血病鸡细胞(C/E)鸡来源的细胞。3.3.4 咽曦、泄殖腔棉拭子取咽喉棉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上顿裂来回刮3次5次取咽喉分泌液;取泄殖腔棉拭子时，将棉拭子深入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便;将棉拭子头一并放入盛有l.5 mL磷酸盐缓冲液的无菌离心管中
10、(含青霉素和链霉素各1000 IU/mL)，盖上管盖并编号，10000r/mn离心5min后取上清备用。3.4 病毒的分离培养与鉴定3.4. 1 病毒的分离培养3. 4. 1. 1 接种培养z病料接种细胞单层后，置于37.C培养箱中培养2h。然后吸去细胞生长液，换入细胞维持液，继续培养5d7 d. 3.4.1.2 细胞传代:将3.4.l. 1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5d7 d。3.4.2 病毒的鉴定3.4.2.1 间接免疫荧光抗体反应(lFA)3. 4. 2. 1. 1 固定将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酣-乙醇(6: 471昆合液室温固定5min，待其自然干2 燥，
11、用于IFA，或置于一20.C保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。3.4.2. 1.2 加第一抗体GB/T 26436-2010 用0.01mol/L磷酸盐缓冲液CpH7.的将单克隆抗体(如抗ALV-亚群特异性单克隆抗体)或抗ALV单因子鸡血清(抗ALV单因子鸡血清的制备见附录C)稀释到工作浓度，在37.C水浴箱作用40 min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。3.4.2. 1.3 加FITC标记二抗按商品说明书用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体(当第一抗体为ALV特异性单克隆抗体，选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体;当第一抗体为鸡抗ALV单
12、因子血清，则选用FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体作为第二抗体)0 37 .C水浴箱作用40 min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。3.4.2. 1. 4 加甘油滴加少量50%甘油磷酸盐缓冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下观察。3.4.2. 1.5 结果观察与判定被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很谈。在放大200X400X时，可见被感染细胞胞浆着色，判为ALV阳性，元亮绿色荧光者判为阴性。3.4.2.2 ALV-p27抗原ELISA检测3.4.2.2. 1 抗原样本制备将病料同3.4.1.1和3.4.1.2所述方法接种细胞，培养7d14 d后取
13、上清液直接检测;也可取细胞培养物冻融后检测;或用从泄殖腔采集的棉拭子。3.4.2.2.2 p27抗原ELISA检测ALV-p27抗原可用商品试剂盒检测，对不同来源的样品，按厂家的说明书操作。当样本在DF1细胞或CEFCC/E品系)上检测出ALV-p27抗原时，判为外源性ALV阳性，否则判为阴性。直接用泄殖腔棉拭子样品检测出p27，说明有ALV，但不能严格区分外源性或内源性。3.5 ALV亚群鉴定3.5. 1 利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测，可以鉴定J亚群ALV，但不能鉴别其他ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群。3.5.2 对分离到的病毒用RT-PCRC上清液中的游离病毒
14、)或PCRC细胞中的前病毒cDNA)扩增和克隆囊膜蛋白gp85基因，测序后与基因序列数据库CGeneBank)中的己知A亚群、B亚群、C亚群、D亚群的gp85基因序列做同源性比较，即可对病毒进行分群。ALV病毒分群方法见附录D。3.6 荧光定量PCR扩增ALV-J该方法适用于鸡群的检疫或ALV-感染的净化，可在较短时间内完成大量样品的特异性检测。血浆或泄殖腔棉拭子样品可直接用于检测，见附录E。3 G/T 26436-2010 4 血清特异性抗体的检测4. 1 仪器和试剂4. 1. 1 试剂:磷酸盐缓冲液洗液、禽白血病抗体ELlSA检测试剂盒、FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体、甘油。4. 1.2
15、 仪器:酶标仪、荧光显微镜、37.C恒温培养箱。4.2 样品的采集样品的采集见3.3. 4.3 抗体的检测4.3.1 ELISA检测可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELlSA检测试剂盒，严格按商品提供的说明书操作和判定。4.3.2 IFA检测4.3.2. 1 抗原抗原制备方法见附录F.4.3.2.2 操作步骤在相应的盖政片上或抗原孔中加入用磷酸盐缓冲液(1 : 50)稀释的待检鸡血清，在37.C下作用40 min，用磷酸盐缓冲液洗涤三次。再加入工作浓度的FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体(第二抗体)，在37 .C作用40mn，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加少量50%甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显
16、微镜下观察。4.3.2.3 结果的判定结果的判定方法同3.4. 2. 1. 5.不论是商品鸡群还是SPF鸡群，只要检出A亚群、B亚群及J亚群抗体阳性的鸡，就表明该群体曾经有过外源性ALV感染。4 GB/T 26436-2010 附录A(规范性附录)0系SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备选择9日龄10日龄发育良好的SPF鸡胚。先用腆酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿内，用元血清的DMEM液洗涤胚体。用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用无血清的DMEM液洗2次3次，然后加0.25%膜酶溶液(每个鸡胚约加1 mL)，在37.5 .C38. 5 .C
17、水浴中消化10min 15 min.吸出膜酶溶液消化产生的悬液，再加入适量的营养液(用无血清的DMEM液，加青霉素、链霉素200IU / mL 500 IU / mL)吹打，用4层纱布滤过。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在1000 r/min下离心5min.将细胞沉淀再混悬于细胞培养液中，制成每毫升含活细胞数约100万150万的细胞悬液，分装于培养瓶(皿)中，进行培养，形成单层后备用(一般在24h内应用)。5 GB/T 26436-2010 附录B(规范性附录)DFl细胞培养基配制B.l 商品化的DMEM液，pH7.2，加5%胎牛血清。青霉素、链霉素:各250IU/mL B.2 培养条
18、件:37.C ，5%二氧化碳。6 GB/T 26436-2010 附录C(规范性附录)抗ALV单因子鸡血清的制备选择经鉴定无任何其他潜在病毒的ALV参考株作为种毒(如经ALV-全基因组cDNA克隆质粒DNA转染SPF鸡的CEF所产生的分子克隆化ALV)，接种C/ECEF后复制和扩增病毒。病毒接种CEF继续培养5d后，再传代一次。将传代长成单层的CEF换成含1%小牛血清的DMEM维持液，继续培养72h96 h后收取上清液(通常可达到最高病毒效价)，分装在离心管中，每支1mL，于一70.C 冰箱保存。2d3 d后，取出一支，用细胞培养液作10倍系列稀释后，分别接种于含有新鲜配制的CEF单层(细胞覆
19、盖面应70%)96孔培养板上，每个稀释度8孔。在37.C下培养6d后，弃上清液，用磷酸盐缓冲液洗一次后，加入预冷的丙酣-乙醇(6: 4)固定。待自然干燥后，用抗ALV寸的单克隆抗体进行IFA(见3.日，以IFA的结果来判定病毒感染的终点，测定其中ALV的组织细胞半数感染量(TCIDso)。选用6周龄以上SPF鸡，SPF隔离器饲养。每只鸡皮下接种104个TCIDso的ALV悬液。4周6周后采集血清。IFA抗体滴度应注1: 100。7 GB/T 26436-2010 附录D(规范性附录)ALV亚群鉴定程序D.l 克隆载体和宿主菌商品化的PCR产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒。可用多种大肠杆菌作
20、为宿主菌，如TG1等。D.2 病毒模板的制备按照以下程序或商品化提取细胞DNA试剂盒的说明书提取细胞DNA。1) 接种病毒的细胞经磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入适量0.25%膜酶，37.C温箱中放置5min 10 min，将细胞消化吹打后收集于1.5 mL离心管中。2) 2 000 r/ min离心收获细胞，然后加入500L抽提缓冲液(100mmol/L氯化铀，10mmol/L Tris.Cl pH8. 0 , 25 mmol/L EDTA pH8. 0 , 0. 5%SDS)悬浮后，加入5L蛋白酶K(100g/mL)，56.C水浴中消化5h。3) 加入等体积的苯酣-三氯甲烧溶液(苯酣z三氯甲烧=
21、异戊醇=25: 24 : 1)约500L抽提一次，将上层液体转移到另一1.5 mL离心管中，加入1/10体积3mol/L的乙酸销和2倍体积无水乙醇后，置于一20.C冷却2h或者更长时间。4) 取出后12000r/min离心10min沉淀DNA，弃去上清液。再小心加入70%冷乙醇轻洗DNA沉淀，弃去上清液。5) 经乙晖沉淀后的DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于50L双蒸水中，即为模板DNA。D.3 囊膜蛋白env基因的扩增D. 3.1 引物可根据已发表资料合成扩增ALV-的前病毒DNA特异性PCR引物，本例示范引物为:正向引物:5-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3，相当于AL
22、V-原型毒株HPRS-103前病毒基因组DNA序列的第5394对第5416对碱基。反向引物:5-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3，相当于ALV-原型毒株HPRS-103前病毒基因组DNA序列的第7811对第7794对碱基。引物用双蒸水稀释为25pmol/L，一20.C保存备用。D.3.2 PCR 以第D.2章中提取的细胞DNA为模板，扩增ALV-的囊膜蛋白基因(env)特异性2.2kb条带，其PCR反应体系(50L)见表D.1。8 GB/T 26436-2010 表D.1 ALV-J env基因PCR反应体系组分体积/L双蒸水30. 5 10X缓冲液(元Mg+)(成分:100 mmol
23、/L Tris. Cl pH8. 0,500 mmol/L氯化饵，1%明跤)5 氯化续(15mmol/L) 4 dNTPs(2.5 mmol/L) 4 正向引物(25pmol/L) 2 反向寻|物(25pmol/L) 2 DNA聚合酶(5U/L) 0.5 模板DNA(约100ng/lL) 2 总体积50 将上述成分分别加入灭菌的PCR管中，轻轻混和均匀，离心后置于PCR扩增仪。按照以下扩增程序进行反应:首轮循环:95.C5 min,50 .C 1 min,72 .C 1 min; 中间循环:95.C1 min, 50 .C1 min, 72 .C2 min30 s，进行30个循环;72 .C延
24、伸10min;4 .C保存。D. 3. 3 PCR产物DNA电泳用微量移液器取4.5LPCR产物加入O.5L的10X进样缓冲液(0.25%澳酣蓝，0.25%二甲苯苯肢，15%聚蔚糖400)，在浓度为0.8%的琼脂糖凝股上进行电泳，同时在另一加样孔加入5LDL2000 DNA Marker。在TAE电泳缓冲液中，90V电压，电泳50min后，于紫外光凝胶成像分析系统中观察并记录结果。D. 3. 4 PCR产物的回收与定量可采用商品化PCR产物回收试剂盒进行回收。1) 将病毒env基因的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝肢上进行电泳，90V电压，电泳50min。2) 将目的条带切割下来，置于已经称重的
25、1.5 mL离心管中。3) 再次称重，计算含目的条带的凝胶块的质量。的按每毫克加入100LUltra Salt，在55.C 65 .C水活锅中使琼脂糖凝肢融化。5) 加入5LGlass Milk，棍匀后室温下放置5min. 的12 000 r/min离心，去掉上清液。7) 加入1mL Ultra Wash洗涤沉淀。的12 000 r/min离心，去掉上清液。再次离心，用微量移液器吸出剩余液体。的干燥后，加入15L双蒸水，用微量移液器吹打温匀后，室温下放置5min , 12 000 r/min离心，将上清液转移至另一离心管中。10) 取1L回收产物在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，另加5LDL2
26、000 DNA Marker，用以估计回收DNA的浓度。9 GB/T 26436-2010 D.4 PCR产物的克隆D. 4.1 连接反应将载体与纯化回收PCR产物于16.C下连接6h8h。连接体系为:载体25 ng 纯化env基因PCR产物溶液I加双蒸水至D.4.2 质粒转化用感受态大肠杆菌的制备100 ng 5L 10L 用氯化钙法制备大肠杆菌TG1菌株的感受态细胞，步骤简述如下:。一个盛约50mLLB液体培养基的锥形瓶，接种大肠杆菌TG1菌株，在37.C恒温振荡器中振荡培养至半浑浊半透明状态。2) 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的一20.C保存的50mL离心管中，冰上放置10min，使
27、培养物冷却至o.C。3) 4.C以4000 r/min离心10min，回收细菌细胞。的倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。5) 用10mL用冰预冷的0.1mol/L氧化钙重悬每份沉淀，冰浴上放置30min. 6) 4C以4000 r/min离心10min，回收细菌细胞。7) 倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。的每50mL初始培养物用1mL用冰预冷的0.1mol/L氧化钙重悬每份沉淀，4.C保存备用。D.4.3 质粒的转化将D.4.1中得到的连接产物转化大肠杆菌，步骤简述如下:1) 10L连接产物加入200L新鲜制备的TG1感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置3
28、0 min。2) 放入42.C循环水浴中，准确热激90s. 3) 快速转移到冰浴中，使之冷却2min3 min. 的每管加LB培养基800L，在37.C摇床上(转速不超过225r/min)，温育45min，使细菌复苏。5) 取200L菌液均匀涂布到含有100g/L氨韦青霉素的LB琼脂平板上。的将平板置于37.C温箱中培养12h，挑取单个菌落培养后，进行质粒DNA的制备与鉴定。D.5 质粒DNA的提取和鉴定D. 5.1 质粒DNA的提取挑选平板上的白色菌落，接种至氨书青霉素浓度为50g/mL的5mL LB液体培养基中，于37.C 摇床上振荡培养6h，提取质粒。1) 菌体的收集za) 将培养液倒入
29、1.5 mL离心管中，12000 r/min，离心1min，倒掉上清液。b) 用1mLTE缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。10 GB/T 26436-2010 2) 将沉淀悬浮于100L用冰预冷的潜液1，在振荡器上强烈振荡混匀。3) 加200L溶液n(不超过5min，溶液E需现配)，颠倒5次(不要强烈振荡)，冰播中放置3 mino 的加150L溶液皿，温和振荡10s，冰浴中放置3min5 mino 5) 12 000 r/min离心5min，将上清液转移至另一离心管中，加入等体积的苯酣-三氯甲烧，在振荡器上振荡?昆匀。6) 12 000 r/min离心5min，将上清液转移至另一离心管中，
30、加入2倍体积的元水乙醇。7) 12 000 r/min离心10min15 min，用1mL70%乙醇漂洗沉淀，干燥DNA沉淀。的用50L双蒸水或TE缓冲液溶解沉淀，同时加入0.5LlLRNase。一200C保存备用。D.5.2 重组质粒DNA的酶切鉴定质粒以EcoR1和Hindm这两种酶进行双酶切鉴定。酶切体系如下:总体和、20L 质粒DNA双蒸水10X缓冲液KEcoR 1 10L 7L 2L 0.5L Hind m 0.5L 以上组分混匀后，轻微离心，37oC酶切2ho于0.8%的琼脂糖凝胶中90V电泳45min，在凝胶成像系统下观察并记录结果。D.6 克隆序列的测定将上一步经EcoR1和H
31、indm双酶切鉴定的阳性克隆测序。所得序列与GeneBank中发布的ALV的A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群和J亚群的囊膜蛋白gp85基因做同源性比较分析，并确定属于哪个亚型。可参考的GeneBank中序列编号分别为:M37980和DQ365814(A亚型hAF052428(B亚型);02342 (C亚型);D10652 (D亚型);M12172、EF467236和AY013303(E亚型hZ46390、AF247391、DQ1l5805、AY897219和EU264064(J亚型)。对于A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和E亚群，核昔酸或氨基酸的同源性应分别大于90%，与哪个参考亚型的同源
32、性最高，即确定是这个亚型。对于J亚群，应与大多数已知J亚群序列的同源性大于80%。11 G/T 26436-2010 附录E(规范性附录)荧光定量PCR扩增ALV-JE. 1 试剂引物和探针序列z选择ALV-特异性env基因序列作为ALV-检测的靶序列，产物长度为138bp。上游引物:5AGAAAGACCCGGAGAAGAC 3; 下游引物:5ACACGTTTCCTGGTTGTT 3气TaqMan探针:5ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG扩，其5端和3端分别标记FAM和BHQ.E.2 样晶采样和前处理样品采样和前处理见3.3.E. 3 核酸抽提及荧光定量PCR检测E. 3. 1 注意
33、事项实验室注意事项参见附录G.E. 3. 2 核酸抽提1) 取n个灭菌的1.5 mL Eppendorf管编号(n为被检样品与阴性对照、阳性对照之和)。2) 每管加入600L细胞裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200L，再加入200L三氯甲烧，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用于颠倒混匀)。于4.C、12000 r/min离心15min. 3) 取与E.3. 2的1)相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf管，加入400L异丙醇(-20.C预冷), 做标记。吸取E.3. 2的1)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L，尽量避免吸出
34、中间层，颠倒海匀。的于4.C、12000 r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干);加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。5) 于4.C、12000 r/min离心10minCEppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)。的4000 r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温下
35、干燥5 min10 min. 7) 加入15LDEPC(焦碳酸乙二醋)水，溶解管壁上的RNA，5000 r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存则需放置在一70.C冰箱。12 GB/T 26436-2010 E. 3. 3 扩增检测E. 3. 3. 1 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。取出J亚群禽白血病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测试剂盒(参见附录H)，在室温下融化后，6 000 r/min离心5s，每个PCR反应按表E.1所示用量配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数十阴性对照+阳性对照十1)。表E.1 PCR反应体系试剂用量/LRT-PCR反应液14.5 T叫酶(5
36、U!p.L) 0.25 逆转录酶0.25 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装15L，转移至样本处理区。E. 3. 3. 2 加样在已分装有PCR反应?昆合液的PCR管中分别加入己提取好的核酸10L，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。E. 3. 3. 3 PCR扩增检测在扩增检测区进行。E. 3. 3. 4 反应条件第一步:42.C30 min, 95 .C 5 min; 第二步:95.C10 s ,55.C 10 s , 72 .C 30 s，5个循环;第三步:95.C 5 s , 60 .C 30 s，40个循环;6
37、0 .C时设置采集荧光。E.3.3.5 荧光素设定报告基团(reportdye)设定为FAM，摔灭基团(quenchdye)设定为BHQ(或Tamra或Eclipse)，参考标记物(referencedye)设定为None。E.4 分析条件设定及结果判定E. 4. 1 质控标准E. 4. 1. 1 综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阔值( threshold)设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。E. 4.1.2 ALV-阳性对照和阴性对照质控标准:阳性对照有S型PCR扩增
38、曲线，而且Ct值(每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数)30;阴性对照元S型PCR扩增曲线，且CtGB/T 26436-2010 值为元。否则此次试验结果元效。E.4.2 结果判定及描述E. 4. 2.1 有S型PCR扩增曲线，且Ct值30的样本为阳性，表明ALV-核酸阳性。元S型PCR扩增曲线，且Ct值为元的样本为阴性样本，表明ALV-核酸阴性。E.4.2.2 对于30Ct值40的样本建议对样品进行复检。若复检后，Ct值40，判为ALV-核酸阳性，否则判为阴性。样品中ALV-核酸阳性，表明相应样品中检出该病毒，相应鸡有ALV-感染。14 GB/T 26436-2010 附录
39、F(规范性附录)IFA法抗体检测用ALV感染细胞的制备在已铺满CEFCC/E)单层细胞的细胞瓶或培养皿中接种O.5 mL含103TCIDso的ALVC如ALV-J)悬液，37.C 5%二氧化碳恒温培养箱中培养，24h后换1%小牛血清的DMEM培养基继续培养。继续培养5d后将细胞单层用膜酶(见附录A)溶液消化分散成悬液，经离心后，重新悬浮于5%小牛血清的DMEM培养基中。将细胞浓度调至每毫升5X105个细胞。在加入盖玻片的培养皿中加入5mL细胞悬液，或在96孔细胞培养板上每孔加入100L细胞悬液。在37.C继续培养4d。将盖玻片从培养皿中取出或96孔细胞培养板弃去培养基，在磷酸盐缓冲液中漂洗一次
40、后，滴加预冷的丙酣-乙醇C6 :。固定液室温固定5min。自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置一20.C保存。15 GB/T 26436-2010 附录G(资料性附录)J亚群禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的实验室规范G.1 实验室设置要求G. 1. 1 实验室分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区，并且明确标识。G. 1. 2 每一区域需有专用的仪器设备，并且明确标识。G. 1. 3 进人各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区经PCR反应提合物配制区至检测区。G. 1.4 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，工作服不能穿离各特定区
41、域。G. 1.5 实验室清洁时应按PCR反应温合物配制区、样本制备区至检测区的顺序进行。G. 1. 6 不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。G.2 工作区域仪器设备配置G. 2.1 样本制备区仪器设备配置2.C8.C冰箱;一20.C冰箱;冰冻台式离心机(二三12000 r/min);混匀器;微量加样器(0.5L10L，5L20L，20L200L，200Ll 000L);可移动紫外灯。G. 2. 2 PCR反应混合物配制区仪器设备配置2 .C8 .C冰箱;一20.C冰箱;台式离心机(二三3000 r/ min) ;混匀器;微量加样器(0.5L10L，5L20L，20L200L，20
42、0Ll 000L);可移动紫外灯。G.2.3 检测区仪器设备配置荧光PCR仪;可移动紫外灯;打印机。G.3 备工作区域功能及注意事项G. 3.1 样本制备区G. 3. 1. 1 标本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行。G. 3. 1. 2 可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。G. 3. 1. 3 用过的加样器吸头放人专门的消毒(例如含次氯酸铀溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等)如出现外溅，作清洁处理并作出记录。G. 3. 1. 4 对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近
43、距离)可以帮助灭活病毒和消除核酸的污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射。G. 3. 2 PCR反应混合物配制区G. 3.2.1 试剂的分装和反应棍合液的制备在本区进行。GB/T 26436-2010 G. 3. 2. 2 在整个本区的实验操作过程中，操作者戴手套。工作结束后立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸铀等化学物质的消毒清洁作用。G.3.3 检测区G. 3. 3.1 在本区进行荧光PCR检测。G. 3. 3. 2 PCR扩增产物不能在本实验室开盖，PCR管抛弃在远离本实验室的垃圾箱中。G. 3. 3. 3 实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照
44、射。17 GB/T 26436-2010 H.1 试剂盒组成附录H(资料性附录)J亚群禽白血病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测试剂盒的组成及使用每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分:RT-PCR反应液Taq酶逆转录酶阴性对照阳性对照DEPC水裂解液H.2 兑明750LX1管12.5LX1管12.5LX1管1. 0 mLX 1管1. 0 mLX 1管1 mLX1管30 mLX1管H. 2. 1 RT-PCR反应液(1X):含50mmol/L氯化饵，10mmol/L Tris. CICpH8. 3) , 2.5 mmol/L氧化镜，0.2 mmol/L dNTP C deoxyribonuc1
45、eoside triphosphate，脱氧核昔三磷酸)混合物，上、下游引物各20 nmol/mL，探针10nmol/mL, 2 mmol/L二硫苏糖醇CDTT)，5%甘油。H. 2. 2 阳性对照:ALV-J靶基因RNA经稀释保存于75%的乙醇中。H.2.3 裂解液为Trizol，于4.C保存，也可采用功能等效的提取试剂。H.3 使用时的注意事项H. 3.1 在检测过程中，严防不同样品间的交叉污染。H. 3. 2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。18 EON-的守NH因。国人民共和国家标准禽白血病诊断技术GB/T 26436-2010 华由t号唔中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.5字数33千字2011年6月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年6月第一版* 书号:155066. 1-42276 24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价GB/T 26436-2010 打印日期:2011年6月29日F002
