1、ICS 67.060 B 20 道昌中华人民主t-、和国国家标准GB/T 26625-2011 粮油检验大豆异黄酣含量测定高效液相色谱法Inspection of grain and oils-Determination of soybean isoflavone一High performance liquid chromatography 2011-06-16发布2011-11-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 26625-2011 本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。目IJ=i 本标准由全国粮油标准化技术委员
2、会归口。本标准起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、九三粮油工业集团有限公司。本标准主要起草人:高勇、杨长志、李铁柱、张洪样、邓立育、王乐、丁丽莎。I c 1 范围粮油检验大豆异黄圃含量测定高效液相色谱法GB/T 26625-2011 本标准规定了高效液相色谱法测定大豆异黄酣(大豆试、黄豆黄素、染料木试、大豆黄素、黄豆黄素试元、染料木素)含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示、精密度的要求。本标准适用于大豆、豆奶粉、豆鼓中大豆异黄酣含量的测定。本标准测试方法的最低检测限为2.5mg/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本
3、标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取，提取液经离心、浓缩、定容、过滤，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。4 试jflJ与材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。4. 1 乙腊:色谱纯。4.2 甲醇。4.3 乙酸。4.4 90%甲醇溶液:取900mL甲醇，加入100mL水，泪匀。4.5 60%甲醇
4、溶液:取600mL甲醇，加入400mL水，混匀。4.6 10%甲醇溶液:取100mL甲醇，加入900mL水，混匀。4.7 0.1%乙酸溶液:取1mL乙酸，置于1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。4.8 0.1%乙酸乙腊溶液:取1mL乙酸，置于1000mL容量瓶中，用乙腊溶解并定容至刻度。4.9 大豆戒(daidzin):纯度不低于98%。4. 10 染料木戒(genistin):纯度不低于99%。4. 11 大豆黄素(daidzein):纯度不低于98%。4. 12 染料木素(genistein):纯度不低于98%。4. 13 黄豆黄素(glycitin):纯度不低于98%。4. 14 黄
5、豆黄素试元(glycitein):纯度不低于98%。4. 15 标准储备溶液配制:4. 15. 1 大豆异黄酣标准储备溶液:分别准确称取适量的大豆戒、染料木戒、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素试元标准品，分别用60%甲醇(4.5)配成浓度为1mg/mL的标准储备溶液。一18.C避G/T 26625-20门光保存，有效期6个月。4. 15.2 大豆异黄酣混合标准中间榕液:分别移取上述各组分大豆异黄酣标准储备溶液(4.15. 1) 0.5 mL于同一10mL容量瓶中，用60%甲醇(4.5)定容至刻度，配制成各组分浓度为50g/mL的大豆异黄酣混合标准中间溶液，0.C4 .C冷藏避光保存，有效
6、期3个月。4. 15.3 大豆异黄酣混合标准工作溶液:分别吸取50.0L、100.0L、200.0L、300.0L、1000.0L 上述大豆异黄酣混合标准中间溶液(4.15.2)于10mL容量瓶中，用10%甲醇(4.6)溶液配成各组分浓度0.25g/mL、0.50g/mL、1.00g/mL、1.50g/mL、5.00g/mL系列的大豆异黄酣混合标准工作溶液，0 .C4 .C冷藏避光保存，有效期一周。4.16 滤膜:0.45m。5 仪器和设备5. 1 高效液相色谱仪:配紫外检测器。5.2 分析天平:感量0.01mg、感量0.01g. 5.3 旋转蒸发器。5.4 超声波清洗器:50W. 5.5 离
7、心机:10 000 r/min。5.6 粉碎机。5. 7 组织捣碎机。5.8 浓缩瓶:250mL. 5.9 样品筛:孔径2.0mm。6 试样制备与保存6. 1 试样制备6. 1. 1 大豆取有代表性样品约500g，用粉碎机(5.6)粉碎使其全部通过孔径2.0mrn样品筛(5.的，混匀，装入洁净容器作为试样，密封备用。6. 1.2 豆鼓取有代表性样品约500g，用组织捣碎机(5.7)捣碎，混匀，装入洁净容器作为试样，密封备用。6.2 试样保存粉碎试样于4.C以下保存。试样制备过程中，应防止样品污染或组分变化。7 操作步骤7. 1 提取称取5g(精确到0.01g)试样于250mL具塞三角瓶中，加9
8、0mL 90%甲醇溶液(4.的，置于超声波清洗器(5.4)中60.C提取30min，在离心机(5.5)中10000 r/min离心10min，上清液转移至250mL 浓缩瓶(5.的中，残渣再加入60mL 90%甲醇溶液进行提取，上清液也转入250mL浓缩瓶，在旋转蒸发器(5.3)60.C浓缩至约40mL.浓缩液转入50mL容量瓶，用10%甲醇溶液(4.6)冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1mL提取液通过0.45m滤膜(4.16)，供高效液相色谱仪测定。7.2 色谱参考条件色谱参考条件如下:a) 色谱柱:RPC18柱(250mmX4. 6 mm，5m)或性能相当的色谱柱;b) 流动相:0.1%乙酸溶液
9、(4.7)和0.1%乙酸乙腊溶液(4.肘，按表1的规定进行梯度洗脱;c) 流速:1. 0 mL/min; 2 , GB/T 26625-20门d) 柱温:40.C; e) 波长:260nm; f) 进样量:20L.表1梯度洗脱表时间/min0.1%乙酸水溶液/mL0.1%乙酸乙腊溶液/mL。90 10 12.5 70 30 17.5 60 40 18.5 。100 21. 0 。100 22.5 90 10 26.0 90 10 7.3 测定参考上述色谱条件(7.2)调节高效被相色谱仪，使大豆异黄酣各组分的色谱峰完全分离。分别吸取20L适当浓度的大豆异黄酣混合标准工作液(4.15.3)和样液C
10、7.1)进行液相色谱测定，分别得到大豆异黄酣各组分的标准工作液峰面积CA)和样液大豆异黄酣各组分峰面积CA;)。如果样破中大豆异黄酣某一组分峰面积与标准工作榕液中的该组分峰面积相差较大时，稀释样液或调整标准工作液浓度后再行测定。在上述色谱条件下，大豆异黄酣各组分的保留时间约为:大豆试8.2min，黄豆黄素8.8min、染料木试11.0 mn、大豆黄素15.3min、黄豆黄素戒元16.3mi旦、染料木素19.4mino标准品的色谱图参见附录A.7.4 空白试验除不加试样外，按7.17. 3操作步骤进行测定。8 结果计算与表示8. 1 大豆异黄圃各组分含量按式(1)计算试样中大豆异黄酣各组分含量(
11、mg/kg)。式中zXiA XCi xV -AiXm Xi 试样中某一大豆异黄酣组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg); A 试样提取液中某一大豆异黄酣组分的峰面积5Ai -大豆异黄酣混合标准工作液中某一组分的峰面积;Ci一一大豆异黄酣混合标准液中某一组分的浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V 试样提取液最终定容体积，单位为毫升(mL);m 试样质量，单位为克(g)。注:计算结果应扣除空白值。8.2 大豆异黄田总含量试样大豆异黄酣总含量为各组分之和，按式(2)计算:X= 2.; Xi . ( 1 ) . ( 2 ) 3 GB/T 26625-2011 式中zX 试样中总大豆异黄酣含量，单
12、位为毫克每千克Cmg/kg)。注:本标准6种异黄酣己包括大豆中异黄丽的绝大部分组分，可认为是大豆异黄翻总含量。8.3 结果表示取两次测定结果绝对差值小于重复性限r的平均值为测定结果，单位为毫克每千克Cmg/kg)，保留三位有效数字。如果两个独立测试结果的绝对差值超过重复性限T，应弃去该测试结果。再重新完成两个独立测试。9 精密度9. 1 重复性在重复性条件下，获得的两个独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限r。各组分大豆异黄酣含量2.5 mg/kg30 mg/kg范围内，其重复性限r计算方程参见附录B。9.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限Ro各组分大豆
13、异黄酣含量2.5 mg/kg30 mg/kg范围内，其再现性限R计算方程参见附录B。4 AU 0.50 0.40 0.30 0.20 o. 10 0.00 0.00 1一一大豆试;2一一黄豆黄素;3一一染料木戒;4一一大豆黄素;5一黄豆黄素试元;6-一-染料木素。5.00 GB/T 26625-20门附录A(资料性附录)大豆异黄酣标准晶渡相色谱图6 2 4 3 5 10.00 15.00 20.00 25.00 lIn 圈A.l大豆异黄酣标准色谱图5 GB/T 26625-2011 附录B(资料性附录)精密度计算本标准的精密度是按照GB/T6379. 1和GB/T6379. 2规定的要求确定的
14、，其重复性限r和再现性限R以95%的可信度来计算。表B.1重复性限r和再现性限R计算方程组分名称含量范围/(mg/kg)样品重复性限7再现性限R大豆r=O. 135 7m+0. 400 0 R=O. 223 9m一0.2762 大豆试2. 530 豆鼓r=O. 127 5m+0. 486 4 R=0.168 5m+0. 3600 大豆r=O. 097 3m+0. 704 7 R=0.235 1m+0. 3089 黄豆黄素2. 530 豆鼓=0.097 6m+0. 806 6 R=O. 184 1m+0. 657 8 大豆r=O. 186 Om+O. 256 8 R=O. 183 6m+0. 4
15、832 染料木戒2. 530 豆鼓r=0.1147m十0.4391 R=0.136 9m+0. 039 1 大豆r=O. 124 1m十0.4810 R=0.159 8m+0. 5105 大豆黄素2. 530 豆鼓r=O. 074 1m十0.7389 R=O. 164 Om-O. 136 8 大豆r=O. 122 3m+0. 544 8 R=O. 161 3m+0. 6762 黄豆黄素试元2. 530 豆E支=0.129 Om+O. 185 3 R=0.071 8m十1.204 1 大豆=0.098 2m+0. 6643 R=O. 137 Om+O. 750 2 染料木素2. 530 豆鼓r=
16、O. 114 7m+0. 579 5 R=O. 088 5m+0. 8544 注:m为该组分的含量，即该组分两个独立测定结果的算术平均值。6 GB/T 26625-20门参考文献lJ GBjT 6379. 1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分z总则与定义2J GBjT 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法FFONlmNNH阁。华人民共和国家标准粮油检验大豆异黄圃含量测定高效液相色谱法GB/T 26625-2011 国由l导中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数13千字2011年9月第一次印刷开本880X12301/16 2011年9月第一版16.00 7G 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价每书号:155066. 1-43362 GB/T 26625-2011 打印日期:2011年9月29日F002
