1、ICS 67.050 x 04 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1422一2007乳及乳制品中乳糖的测定酶一比色法Determination of lactose in milk and milk produc也Enzyme-colorimetric method (IDF79B: 1991 , Dried milk, dried ice-mixes & processed cheese determination of lactose content enzymatic methods, MOD) 2007 -06-14发布2007 -09-01实施中华人民共和国农业部发布NY /T 1
2、422-2007 目U亩本标准修改采用IDF79B:1991乳粉、冰棋淋粉和加工干略中乳糖含量削定一酶法H英文版)。本标准根据IDF79B:1991重新起草。考虑到我国国情，本标准与该国际标准的主要差异如下:一一试剂部分增加酸度调节剂氢氧化铀、硫酸以及酶试剂硫酸接的配制方法;一一增加试样制备一章，包括液体、国液体、固体试样的制备;一一分析步骤中增加标准曲线的绘制，由试液吸光度测定与标准系列比较定量，不采用国际标准中摩尔吸光系数计算定量;一一以试剂空白和试液空白扣除干扰组分和葡萄糖本底值，不采用国际标准中吸光度减量计算;一一免去国际标准中预试验和试验报告章条:一一增加附录A，规定酶的技术要求、试
3、验方法及判定规则:一一编写格式、用语遵照我国标准GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分:标准的结梅和编写规则和GB/T20001.4-2001(标准编写规则第4部分:化学分析方法比本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国科学院忧阳应用生态研究所农产品安全与环境质量检测中心。本标准主要起草人:王颜红、林桂风、王世成、张红、杨玉兰、齐伟。I NY/T 1422-2007 乳及乳制品中乳糖的测定酶一比色法1 范围本标准规定了乳及乳制品中乳糖含量的酶一比色法测定方法。本标准适用于乳及乳制品中乳糖的测定。本标准试液
4、的检出限为0.5g/mLo2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理在自由半乳糖昔酶(-GLS)催化下，乳糖被酶解为P葡萄糖(G)和P半乳糖(GL)。己糖撒酶(HK)将D葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(创刊，同时将三磷酸腺背(ATP)转化为二磷酸腺昔(ADP)。受6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)催化，命磷酸葡萄
5、糖氧化为命磷酸葡萄糖酸(GA6凹，同时烟酷股腺瞟岭二核昔酸磷酸(NADP+)被还原成还原型烟眈胶腺瞟岭二核昔酸磷酸(NADPH)。在波长340nrn处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。阶GLSY2日22011(L) +呵。一一D-Cr;H1206(G)+ D-Cr;H1206 (GL) D-C6H1206(G)十ATPZELG6P+ADPL _ G6PDH G6P+ NADP+ + H20一一一一:GA6P+ NADPH + H + 4 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验用水应符合GB/T6682的规定。4.1 31 g/L亚铁氟化押溜溜称取3.5
6、5g三水亚铁氟化梆(Fe(CN)6J3H20)溶于水，稀释至100mL，棍匀。4.2 40 g/L硫酸铸溶液称取7.13g七水硫酸悻(ZnSC.7日20)痞于水，稀释至100mL，棍匀。4.3 2 moIlL硝酸溶被瞥告一一稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断揽动。否则会引起爆炸。用水稀释放硫酸Vl.Q+ Vs.o。4.4 4 g/L氢氧化纳溶液称取0.4g氢氧化铀(NaOH)榕于水，稀释至100mL，混匀，置于聚乙烯塑料瓶中。4.5 200 g/L氢氧化铀溶液称取20.0g氢氧化铀(NaOH)榕于水，稀释至100mL，棍匀，置于聚乙烯塑料瓶中。4.6 422 g/L畸酸锻溶施称取42.
7、2g硫酸锻(N)2S04)溶于水，稀释至100mL，混匀。1 NY IT 1422-2007 4.7 拧槽酸缓冲溶液，pH6.6 称取2.8g二7:.拧攘酸三铀(4HS7Na3. 2同时，0.042g一水拧攘酸(C Hs ? H20)和0.625g七水硫酸镜(MgS04，7日20)，陪于约40mL J.中，混匀。用2mol/L硫酸榕液(4.3)或4g/L氢氧化铀搭液(4.4)将pH调至6.6:t0.1，定容至50mL，泪匀后放置。t-4C昨箱中，可保存3个月，使用前放置至室温。4.8 三Z醇膜(四川缓冲溶液，pH7.6 称取14.0g三乙醇腊盐酸盐(CH15NQ，. HC1) ,0.25 g七
8、水硫酸镜(MgS047H20)梅于约80mL水中，用200g/L氢氧化铀洛液(4.5)将pH-lJ可至7.6土0.1，稀释至100mL，泪匀后放置。t-4t冰箱中，可保存2个月。4.9 NADP+一ATP-TEA摆j幡班称取65mg烟眈腊腺瞟岭二核昔酸磷酸二fJ盐(CzIH26N7017P3N龟，纯度98%-99%)和170mg 5-三磷酸腺昔二铀盐(ClOH14Ns013P3Na2，纯度99%-100%)，瞎子30mL三乙酶胶缓冲浩液(4.8)中，1昆勾后放置。c-4t7J箱中，可保存2周，使用前放置至室泪。4 . 10 p-GLS- (NlLt hS04悬浊班将仕半乳糖昔酶(-GLS，埃希
9、氏大肠杆菌，EC3 . 2. 1. 23 )加入422g/L硫酸镣榕液(4.6)中，使伊半乳糖昔酶的活性不低于60IU/mL(技术要求应符合附录A的规定)，缓慢搅匀成悬浊班后放置ot-4t冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应摄入冰水中。4.11 1亚-G6PDH-(NH4) 2S04悬浊液将己糖激酶(目(，酵母，EC2.7.1.1)和6-磷酸葡萄糖眈氨酶(G6PDH，酵母，EC 1. 1.1. 49)加入422g/L硫酸锻梅榷(4.6)中，使己糖激酶的活性不低于280IU/mL(技术要求应符合附录A的规定)，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性不低于140IU/mL(技术要求应符合附录A的规定
10、)，缓慢搅匀成悬浊液后放置。C-4t冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。4.12 乳糖标准溶班称取经87C干燥至恒重的一水乳糖(C12H220nH20)0.842g，精确到0.0001g，溶于水中，定容至100 mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述榕液，用水定容至100mL，即得80g/mL乳糖标准溶液，现用现配。5 仪器实验室常规仪器及以下各项:5. 1 分析天平:感量0.1mgo 5.2 比色管:lOmL，带盖。5.3 紫外可见分光光度计:340nm ,1 cm比色皿。5.4 恒温水、陆锅:士1C。5.5 组织捣碎机。6 试样制备6. 1 固体试样取有代表性的样品至少
11、20g，用组织捣碎机(5.5)捣碎均匀，置于密闭的现璃容器内。6.2 固液体试样取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机(5.5)捣碎均匀，置于密闭的玻璃容器内。6.3 灌体试样取有代表性的样品至少200g，充分棍匀，置于密闭的政璃容器内。2 NY/T 1422-2007 7 分析步骤7.1 试液制备用分析天平(5.1)称取试样，放置于100mL玻璃烧杯中，固液体试样或液体试样称取2g，固体试样称取0.2g，均精确到0.1mg。加人的20mL 40C -50C热水，搅匀成乳浊状或悬烛状试料，转移至250mL容量瓶中o用刻度移鞭管依次加入5.0mL亚铁雹化饵溶液(4.1)，5.0mL、硫酸悻潜
12、液(4.2)和10.0 mL 4 g/L氢氧化铀榕被(4.4)，每次加入后均应充分摇匀。定容，r昆匀，静置30mi口，过墟，弃去最初掠液约30mLo吸取5.00mL滤液于100mL容量瓶中，定容，即为试液。7.2标准曲线绘制用微量移被管吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.邸，1.00mL乳糖桥准洛:在(4.12)，分别置于10mL 比色管(5.2)中，各加入0.20mL拧攘酸缓冲悔?夜(4.7)，0.05mL -GLS-(N问)2S04悬浊液(4.10)，摇匀，于36C+ 1 c恒温水路锅(5.4)中恒温15mino取出后加入1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲搭液(4.9)
13、 ,0.05 mL HK-QSPDH-(NH4)2S04镜悬浊被(4.11)，播匀，于36C:t 1 c恒温水洛锅中恒温60mln。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5mino用lcm比色皿，以乳糖标准搭搜含量为0.00的试剂溶班作参比，在波长340nm处削定各比色管内榕液的吸光度。以乳糖含量为纵坐栋，以吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。7.3 试洁的测定用微量移液管吸取1.00mL试液(7.1)，置于10mL比色管中，加入0.20mL拧攘酸缓冲溶掖，1.00 mL NADP+ -ATP-TEA缓冲溶辙，0.05mL HK-G6PDH-(N)zS04悬浊液，摇匀，于36C+
14、1 c恒温水恪锅中恒温60mn，取出，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀。此榕破即为空白榕液。用微量移液管吸取1.00mL试液(7.1)，置于10mL比色管中。以下按7.2各加入0.20mL拧攘酸缓冲溶液(4.7)用1cm比色皿操作，以空白溶攘作参比，在波长340nm处测定比色管内试液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量。8 结果计算乳及乳制品中乳糖的含量，数值以克每百克(g/100g)表示，按下式计算:x-cVl V3 一-10 000mV2 V4 式中:X一一乳及乳制品中乳糖的含量，单位为克每百克(g/100g); c一一标准曲线上查出的试被中乳糖的含量，单位为微克(g);m一一
15、试料的质量，单位为克(g); V1一一试料经脱蛋白处理后的定容体积，250mL; Vz-一一股取滤液体积，5.00mL; V3一一滤液定容体积，100mL; V4-一一吸取试液体积，1.00mLo 两个平行样测定算术平均值的计算结果保留3位有效数字。9 精密度9. 1 重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值算术平均值的6%。3 NY IT 1422-2007 9.2 再现性在再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值算术平均值的14%。4 NY IT 1422-2007 附录A(规范性附录)p-半乳糖苦酶、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的技术
16、要求、试验方法及判定规则A.1 技术要求仕半乳糖昔酶、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶按其活性计算都不应含有大于0.01%的以下各种酶:日果糖昔酶、淀粉葡萄糖昔酶、纤维素酶、-糖昔醋、葡萄糖脱氢酶和NADPH氧化酶。A.2 试验方法用微量移搜管吸取O.8mL乳糖标准榕液(4.12)，置于10mL比色管(5.2)中，加入32g/mL的蔚糖(分析纯)、可搭性淀粉(分析纯)、麦芽糖(生化纯)和纤雄二糖(生化纯)的搞合榕悔lmL。以下按7.2加入0.02mL特攘酸援冲溶液(4.7)在波长340nm处测定比色管内榕液的吸光度。操作。在标准曲线(7.2)上查出对应的乳糖含量。乳糖的测定回收率以质量分数(%)
17、表示，按下式计算:式中:R=一c一Xl000.8x80 C一一从标准曲线上查出的试液中乳糖含量，单位为微克(g)oA.3 判定规则乳糖测定回收率，如在85%120%范围内，则判定伊半乳糖昔酶、己糟撒酶、6-磷酸葡葡糖脱氢酶符合技术要求。5 hCON-NN寸FH问Z中华人民共和国农业行业标准乳及乳制品中乳糖的测定酶一比色法NY /T 1422-2007 * 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争夺+夺印张0.75字数7千字2007年8月北京第1次印刷印数:1 500册定价:10.00元击毛* 争夺开本880mmx 1230mm 1116 2007年8月第1版书号:16109 1237 版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894 t422二2007
