1、ICS 65120B 46中华人民 共禾I：lN Y国农业行业标准NYT 1 4582007饲料中盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的同步测定高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法Simultaneous determination of promethazine hydrochloride，chlopromazine hydrochloride，diazepam，perohenazine andthioridzine hydrochloride in Feeds by high performance liquidchromatography and liquid chroma
2、tography-mass spectrometry20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 昌NYT 1458 2007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由农业部饲料效价与安全监督检验测试中心(北京)、中国农业大学负责起草。本标准主要起草人：杨文军、张丽英、常碧影、王宗义、贺平丽。饲料中盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的同步测定高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法NYT 145820071范围本标准规定了以高效液相色谱法(HPl(：)和液相色谱质谱联用法(LCMS
3、)同步测定饲料中盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及添加剂预混合饲料的测定，每种药物最低检出浓度HPLC法为1 mgtkg；LCMS确证法为02 ragkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样3原理用酸性乙腈提取试样中的5种药物。提取液
4、经氮气吹干，用稀盐酸溶解后，通过固相萃取小柱(SPE)净化，在HPI。C反相柱上分离，紫外检测器定量测定，质谱法确证。4试剂和溶液除非另有说明，在色谱分析中仅使用确认为色谱纯的试剂，其他试剂选用分析纯即可。水为符合GBT 6682一级用水的规定。4 1甲醇。4 2乙腈。4 3无水甲酸。44氨水。45盐酸。46 01的甲酸溶液：将1mI。无水甲酸(43)用水定容至1 000mI。，通过045 pm滤膜。4 7样品上柱稀释液和淋洗液l：c(HCI)一o02molI。的盐酸溶液。将167mL盐酸(45)用水定容至1 000mL。48淋洗液2：c(HCD一01 moll。的盐酸溶液。将833 mL盐酸
5、(45)用水定容至1 000 mI。49淋洗液3：甲醇。4 10洗脱液：2氨水的甲醇溶液。将2 mI氨水(44)用甲醇定容至100 mI。4 11 中性洗脱液：取洗脱液(4】o)975 mI。，加入25 mL无水甲酸(43)混匀，现配现用。412提取液：r(HCl)-05 toolL的盐酸溶液。将417 mI，盐酸(45)用水定容至100 mL和乙腈(42)，(1+9，v口)。1NYT 14582007413标准溶液。4 13 1标准储备液：分别称取盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的标准品0100 0 g(根据所购对照品纯度计算称样量)，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇
6、(41)溶解并定容至刻度，其浓度各分别为l ragmI。冰箱中冷藏，有效期为一周。4 13 2标准工作液：分别移取五种标准储备液(4131)于同一棕色容量瓶，用中性洗脱液(411)依次稀释配制成标准工作液，浓度分别为01tLgmL、05ugml。、1tzgm1、5tzgmL和10 pgmL。现配现用。5仪器设备51分析天平：精度01mg。5 2超声波清洗器。53离心机。5 4往复式振荡器。5 5旋涡混合器。5 6高效液相色谱质谱联用仪：具有C。柱、紫外检测器和大气压电离源。5 7反相c，。和阳离子混合型固相萃取纯化小柱(简称“SPE”)或类似小柱(1 mI，30 mg)。58氮吹仪。5 9固相
7、萃取仪。6试样制备按GBT】46991-2005规定的方法采样，选取有代表性的饲料样品1 000 g，用四分法缩至200 g左右，粉碎并全部通过045mm筛，混匀，装入磨口瓶中，低温避光保存备用。7测定步骤71提取称取适量试样(表1)，精确至10mg，置于50mL具塞离心管中，准确加入提取液(412)40mL，置于往复式振荡器以120 rmin振荡提取25 rain。然后，4 000 rrain离心8 rain。将上清液转移至100mL棕色容量瓶中。再分别用40mI和20mI。提取液(412)，振荡提取10rain，4 000 rmin离心8rain，合并上清液于棕色容量瓶中，用提取液(412
8、)定容至刻度，摇匀，普通滤纸过滤。表1 试样称样量和滤液移取体积项 目 配合饲料 浓缩料 预混料称样量，g 500 2oo 1oo取滤液体积，mI。 2o 1 0 05滤液用氮气吹至，m1 O 5 0 5 057 2吹干溶解取配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混料滤液适量(表1)，于10mI。离心管中，置于60水浴氮气吹至05 mL，分别加2 mI上柱稀释液(47)溶解，超声约30 s，并旋涡混合数秒，备上固相萃取小柱净化使用。7 3净化73 1 SPE小柱活化：先用1 mI。甲醇和l mI。水活化小柱，小柱内填料不得抽干。7 3 2上样淋洗：将稀释的滤液注入SPE小柱，依次分别用2mI，淋洗液1(
9、47)、2mI淋洗液2(48)9NYT 1458-2007和2 mL淋洗液3(49)淋洗小柱。7 3 3洗脱：用2 ml。洗脱液(410)洗脱小柱。洗脱下来的溶液加50“L甲酸(43)中和，混匀，作为试样液上机使用(试样液在冷藏冰箱中可保存2 d)。7 4测定7 41高效液相色谱条件色谱柱：c，。柱，柱长150 mm，内径4，6 mm，粒度5“m或类似分析柱。柱温：室温。流动相：A：乙腈；B：01的甲酸溶液(46)，梯度洗脱程序见表2。流速：10 mLmln。检测器：紫外检测器。检测波长：251 nm。进样量：20”L。表2梯度洗脱程序时间 乙腈，A 01甲酸溶液，Bmln 曲 线000 28
10、 72 l200 28 72 1800 39 61 69 00 80 20 61300 80 20 61400 28 72 】1900 28 72 27，42液相色谱质谱条件：质谱柱：c。柱，柱长150mm，内径21mm，粒度5“m或类似分析柱。流动相：同高效液相色谱法。流速：025 ml。rain。进样量：10 fzI。EI+源电压：30 kV。源温度：110。脱溶剂温度：350。脱溶剂气流速：300 Lh。反吹气流速：150 I。h。7 5定性和定量方法7 5 1液相色谱法a) 定性方法：除了用保留时闻定性外，还可用二极管阵列检测器测定每种药物紫外光谱的匹配度，盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西
11、泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静个f发收峰分别为：240 nm、250nm和297 nm；235 nm、255 FtGq和306 nm；238 nrrl、285 nm和313 nm；238 nm、262 nm和308nm；240 nm、255 D-Fn和304 nm(色谱图参见附录A)。b)定量分析：向色谱仪分别注入标准溶液和试样液，积分得到峰面积，用单点或多点标准法定量。7 5 2液相色谱质谱方法a) 定性方法：试样与标准品四个特征离子需同时出现。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于05。每种药物的4个特征离子基峰百分数与标准品允许差分别为：当基峰百分数50NYT 1458 2007时，允许差20；
12、当基峰百分数为2050时，允许差25；当基峰百分数为lo20时，允许差30；当基峰百分数10时，允许差50。b)定量方法：根据每种药物的定量锥孔电压，提取准分子离子的色谱峰面积，单点或多点标准法定量(表3)。表3质谱定性定量及特征离子情况名 称 锥孔电压v 特征离子，mz定量 15 准分子离子(M+1)+285盐酸异丙嗪定性 17 mz 86、240、285、286定量 15 准分子离子(M+1)+319盐酸氯丙嚷定性 23 mz 58、86、319、321定量 20 准分子离子(M+1)7 285地西泮定性 37 mz 105、154、285、287定量 20 准分子离子(M+1)+404奋
13、乃静定性 37 mz143、17l、404、406定量 15 准分子离子(M+1)+371盐酸硫利达嗪定性 30 m：98、126、371、3728结果的计算与表述试样中药物含量。，以质量分数(mgkg)表示，按式(1)计算：GA，V1U 叫一百X可S丁L1J式中：m待测试样中每种药物含量，单位为毫克每千克(ragkg)；G一一药物标准工作溶液浓度，单位为微克每毫升(tgmL)；A测得的色谱峰面积；A，标准溶液色谱峰面积；m试样质量，单位为克(g)；V。一试样中加入提取液(413)的体积，单位为毫升(ml。)；U净化过程SPE小柱洗脱液(411)的体积，单位为毫：f1-(ml。)；V：提取液(
14、413)加入SPE小柱的体积，单位为毫升(ml。)。9允许差在同一实验室由同一操作人员，使用同一台设备完成的两次平行检测结果，液相色谱测定方法相对偏差不大于10，质谱确证方法两次平行检测结果相对偏差不大于20。0 0NYT 1458 2007附录A(资料性附录)盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静标准图谱2 oo 3 00 4 00 5 00 6 00 700 8 00 9 00 1000 11 00图中以标准品色谱保留时间为307 min、384 rain、557 rain、622 rain和1015 mln的出峰顺序分别为盐酸异丙嗪、奋乃静、盐酸氯丙嗪、盐酸硫利哒嗪和地西泮。
