1、ICS 65120B 46N Y中华人民共和国农业行业标准NYT 1463-200720071218发布饲料中安眠酮的测定高效液相色谱法Determination of methaqualone in feedsby high-performance liquid chromatography20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 置NY!T 14632007本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)、农业部饲料质量监督检验测试中心(西安)。本标准主要起草人：汤文利、任爱丽、梁萌、徐强、陈淑沂、忽桂
2、香。饲料中安眠酮的测定高效液相色谱法NYT 1463-20071范围本标准规定了用高效液相色谱仪(HPLC)测定饲料中安眠酮的检测方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料的检测。方法的定量限为15 mgkg，检测限为05mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样3原理在碱性条
3、件下，用三氯甲烷和异丙醇的混合溶液将饲料中的安眠酮提取出来，将提取液蒸至近干，用甲醇溶解残渣，在HPLC上分离、测定。4试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水符合GBT 6682中一级水和三级水的规定。一般化学分析用三级水，高效液相色谱分析用一级水。4 1乙腈：色谱纯。4；2甲醇：色谱纯。4 3碳酸钠饱和溶液。4 4氯化钠。4，5提取液：异丙醇+三氯甲烷一1+3。46乙酸铵溶液：c(CH。COONH。)-26 mmolL准确称取1927 g乙酸铵于1 000 mL容量瓶中，用一级水溶解、定容，用46“m的水相微孔滤膜过滤。4。7 HPLC流动相：乙腈(41)+乙酸铵溶液(4，6
4、)=30+70，用前超声脱气5 mn。4 8安眠酮标准贮备溶液(100扯gmL)：准确称取101 mg安眠酮标准品(99o)于100 mL容量瓶中，用甲醇(42)溶解、定容。置于4。C冰箱中保存，有效期1个月。49安眠酮标准工作溶液：分别准确移取安眠酮标准贮备溶液(48)100mL、3，00mL、500mL于100mL容量瓶中，100mI2 00mL、300mL、500mI。于lomI。容量瓶中，用甲醇稀释、定容，配制成标准工作溶液，质量浓度分别为100 mgL、300 mgL、500 mgL、1000 mgL、2000 mgL、3000mgL、5000 mgL。现用现配。5仪器5 1实验室用
5、样品粉碎机。5 2分析天平：感量01mg。1NYT 1463-200753离心机：4 360g。5 4超纯水器。5 5超声波清洗器。5 6旋涡混合器。5 7带盖塑料离心管：100 m【，。58旋转蒸发仪。59高效液相色谱仪，由下述部件组成5，915925 9 3确证。594595柱。泵，无脉冲，能将流速保持在01 mLrain20 mLrain。进样系统，进样环体积20”L50 pL。紫外检测器，适合在波长226 nlTl测定。如可能可使用二极管阵列检测器，其还能用于安眠酮的工作站。保护柱：柱长125 mm，内径46 13n110，填有粒度为5 pm的c，s键合硅胶或质量相当的其他保护596分
6、析柱：柱长250 rflim，内径46mm，填有粒度为5”m的c-s键合硅胶柱或性能相当的其他分析柱。分析柱的性能应确保以下条件：安眠酮的容量因子K 71。注：容量因子按式(1)计算：K 7一巫一1(1)t式中：K容量因子；tR-一安眠酮的保留时间，单位为分钟(rain)；f不保留成分的保留时间，单位为分钟(rain)。6试样的制备按GBT 146991的规定进行采样。选取具有代表性的实验室样品l 000 g，用四分法缩减分取200 g左右，粉碎过045mm孔径的筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。7分析步骤7 1提取称取约2 g试料，精确到01mg，放人离心管(57)中，加入氯化钠(44)2 g
7、，加入15mI。三级水，用碳酸钠饱和溶液(43)调pH至1011。加入20 mI。提取液(45)，轻摇数秒；加盖密封，旋涡(56)混匀数秒，放气；旋涡混匀30 s两次；离心机(53)离心5mln吸取下层溶液于具塞试管中。再加入提取液20 mL，重复上述操作，合并两次提取液，旋涡混匀。全部转移到100 mL鸡心瓶中，在50下用旋转蒸发仪(58)蒸发至近干，用500 mL甲醇溶解残渣，旋涡混匀，使溶液中安眠酮的质量浓度在100mgI5000mgI之间。否则，需要重新调整溶液的稀释倍数。用中o45“m的有机微孔滤膜过滤，在高效液相色谱仪(59)上进行分离、测定。72 HPLC分析7 2色谱条件流动相
8、流速：100 mIrain；9NVT 1463-2007进样量：20“L；检测波长：226 nm。7 2 2分析程序7 2 2 1 向HPI，C分析仪中连续注入安眠酮工作液(49)，直至得到基线平稳，峰形对称而且峰高或峰面积能够重现的安眠酮峰，即三个连续测定的峰高或峰面积中最大与最小值之问的差异小于其平均值的5 oA。安眠酮峰应是对称的(凡2)。注：厶为安眠酮峰峰高10处，尾半部峰宽与前半部峰宽之商。两个安眠酮工作液所得色谱峰峰高与浓度之间应有正比例关系。如果偏差大于5，则需制备新的工作液。7 22 2依次注入安眠酮工作液(49)、五个试样溶液(71)和安眠酮工作液(49)，观察工作液的峰高或
9、峰面积差异不得超过均值的5。可依此顺序不断加入待测样品。8确证81总则如果从峰形、测定数值对安眠酮的峰产生了怀疑，或所测定安眠酮含量低于15 mgkg，则应用重叠色谱分析(82)或二极管阵列检测器(83)来确证。8 2重叠色谱法于样品提取液中加入适量的安眠酮工作液(49)，加入的量应与提取液中安眠酮的量相当。依次注入样品提取液、安眠酮工作液和添加了安眠酮的样品提取液。如果添加提取液样品峰的半峰宽变化不大于10，且峰高或峰面积发生了成比例的变化，则可确证原安眠酮峰就是安眠酮的。8 3二极管阵列检测器831条件测定条件同721的规定，只是将紫外检测器换为二极管阵列检测器，具体参数如下：参数 设定测
10、定波长 226 nm频带宽度4 nm(B JJ波长226 nm+2 nm)参比波长 360 nm参比频带宽度 100 nm光谱范围 190 nm400 nm光谱值 基线、峰最大值、上升斜率和下降斜率拐点83 2步骤HPI。C系统稳定后，依次注入1000gmI。的安眠酮工作液(49)、有疑问的样品提取液和又一1000 pgmI，的安眠酮工作液(49)。记录、存储各个色谱峰的基线、最大值以及峰两侧的拐点数据。8 3 3评价将样品峰不同光谱值(样品基线)归一化并绘制成图，记录峰值和峰前后的拐点值。分别将样品峰光谱和安眠酮工作液的光谱归一化，并绘图。在峰顶处标示。834确证标准样品峰只有满足下述条件，
11、才能证实是安眠酮：a)样品峰的保留时间应与标准峰的保留时间相同(差异5)，如有怀疑，需做标准物添加(即将标准物加到样品中)实验。b)样品峰的纯度评定是基于所记录的峰顶、上升斜率拐点和下降斜率拐点不同光谱的符合程度。3NVT 1463一一2007所有光谱图每个波长的相对吸收值应该相等(差异15)。c)波长大于220 nm、样品光谱图与标准光谱图在相对吸收至少等于10的部分无明显区别，样品峰和标准峰的最大吸收波长相同，即其差异不大于检测系统分辨率决定的范围(一般是2 nm4 nm)，两个光谱图任一观察点的偏差均不能超过该特定波长下标准测定物吸收值的15。9结果计算通过比较试样溶液色谱峰的峰高或峰面积和在样品前后注入的安眠酮工作液的峰高或峰面积的平均值定量。饲料中安眠酮的含量x，以毫克每千克(ragkg)表示，按式(2)计算： x一样(2)式中：P，一安眠酮试样溶液峰面积的响应值；Pz安眠酮标准工作溶液峰面积的响应值；p 安眠酮标准工作溶液的浓度，单位为毫克每升(ragL)；V2一一试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；m试料的质量，单位为克(g)。每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果，结果保留三位有效数字。10重复性在同一实验室，由同一操作人员，用同一台仪器完成的两个平行测定结果，相对相差小于8N。4
