1、ICS 67.050 x 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 829-2004 牛奶中氨节青霉素残留检测方法HPLC Determination of ampicillin residue in milk: HPLC 200408-25发布060727000276 2004-09-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准的附录A为资料性附录，附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(广州)。本标准主要起草人:罗道栩、曾平、肖田安、邓国东。NY /T 829-2004 I 1 范围牛奶中氨韦青霉素残留检测方法一-H
2、PLC本标准规定了牛奶中氨节青霉素残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于牛奶中氨韦青霉素的残留量检测。2 规范性引用文件NY /T 829-2004 下列文件中的条款通过标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBf6682 分析实验室用水规格和试验方法3 制样3.1 样晶的制备取适量新鲜或室温下解冻的冷冻空白或供试牛奶。3.2 样晶的保存一20C以下冰箱中贮存备用。4 测定方法4. , 方
3、法提要或原理试样先经三氯乙酸溶液沉淀蛋白，上清液中的氨韦青霉素与甲醒在酸性条件下，加热生成2-起基-3苯基+甲基毗嗦(氨节青霉素荧光衍生物)，该衍生物用带有荧光检测器的高效液相色谱在激发波长(Ex )346 nrn、发射波长(Em)422 nrn条件下测定，外标法定量。4.2 试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GBf6682规定的二级水。4.2.1 氨韦青霉素标准晶含氨节青霉素(C16H18N3Na04S)不得少于85.0%0 4.2.2乙腊色谱纯4.2.3 三氯乙酸4.2.4 甲醒溶液4.2.5浓磷酸4.2.6 磷酸二氢押4.2.7 磷酸盐缓冲液(O. 02mo
4、llL, pH3 .5) 称取2.7218g磷酸二氢饵，置于1OmL容量瓶中，加水9mL使溶解，再用浓磷酸调pH至3.5土O.时，加水稀释至刻度，摇匀即得。1 NY IT 829-2004 4.2.8 三氯乙酸水灌液(200mg/mL) 称取三氯乙酸20g，溶于80mL水中，加水稀释至100mL，摇匀即得。4.2.9 三氯乙酸水溶液(750mg/mL) 称取三氯乙酸75g，加水适量，使溶解，并稀释至100mL，摇匀即得。4.2.10 7%甲醒水溶液量取37%甲醒18.9mL，加水至100mL，摇匀即得。4.2.11 20%乙睛水溶液量取20mL乙腊至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得
5、。4.2.12 氨节青霉素标准贮备液(1000问ImL)准确称取氨韦青霉素标准品约0.1155g，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成1000g/mL标准贮备液，置于4C冰箱中保存，存放期为1周。4.2.13 氨节青霉素标准工作液精密量取氨节青霉素标准贮备液适量，用水稀释成适宜浓度的标准溶液(0.001问ImL0.100陆/mL)，即得。临用前配制。4.3 仪器和设备4.3.1 高效液相色谱仪(配荧光检测器)4.3.2 冷冻离心机4.3.3 分析天平感量。.0001g) 4.3.4 旋涡振荡器4.3.5 恒温水浴锅4.3.6 微孔滤膜(0.45m)4.4 测定步骤4.4.1 试样的
6、制备试样的制备包括:一一取新鲜或室温下解冻后的牛奶，以3500r/min离心10min，取下层液作为供试试样:一一取新鲜或室温下解冻后的空白牛奶，以3500r/min离心10min，取下层液作为空白试样;一一取空白试样，添加适宜浓度的标准工作榕液作为空白添加试样。4.4.2 提取精密量取试样5.0mL- lO mL，置于塑料离心管中，加人三氯乙酸水溶液(750mg/mL)0.5 mL:t 0.01 mL，盖紧后剧烈振摇30s。然后，以6500r/min的速度离心10min，量取上清液1mL:t 0.01 mL 于10mL螺口刻度离心管中。4.4.3 衍生化在盛有1.0mL离心上清液或标准工作液
7、的lOmL螺口刻度离心管中，加人三氯乙酸水溶液(200mg/mL)0.2 mL和7%甲醒溶液0.2mL，旋涡混匀20s，加盖拧紧后置于沸水浴中加热30mino取出，冷却至室温，用20%乙睛水溶液定容至2mL，混匀后，经0.45m微孔滤膜滤过至样品瓶中，供高效液相色谱分析。4.4.4 测定4.4.4.1 色谱条件2 色谱柱:C18,250 mrn x 4.6 mrn(i. d.)，粒径5m，或相当者;流动相:磷酸盐缓冲液一乙脯(75+25，vlv);流速:1时jmin;荧光检测器:激发波长346nm，发射波长422nm; 进样量:100L。4.4.4.2 测定法NY /T 829-2004 取适
8、量试样榕液和相应浓度的标准工作液，进行单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样溶液中的氨韦青霉素的响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，氨韦青霉素的保留时间在8.3min左右，标准溶液液相色谱图见附录A中图A.1-A.3，空白添加试样的色谱图见附录A中图A.5-A.7。4.4.5 空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤(4.4.2-4.4.4)进行平行操作。空白试样的色谱图见附录A中图A.4。4.5 结果计算和表述供试样品中氨卡青霉素的残留量按式(1)计算:Ax Cs x ( V + 0 . 5) X二.、，v7.，4nnnunu-HH-HH-HH-HH-(
9、1)式中:X 一一供试样品中氨节青霉素的残留量，单位为微克每升(glL);A一一供试试样中对应氨韦青霉素的色谱峰面积;As -标准工作液中氨韦青霉素的色谱峰面积;Cs -标准工作液中氨韦青霉素的浓度，单位为微克每毫升(g/mL);V一一供试样品的量，单位为毫升(mL)。注:测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留到小数点后2位。5 检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1 灵敏度本方法在牛奶中的检测限为1glL，定量限为2glL。5.2 准确度本方法在2glL、4glL、10周IL添加浓度水平上的回收率-m.围为70%-110%(回归试验按附录B操作)。5.3 精密度本方法的批内变异系数CV运10
10、%，批间变异系数CV:二15%。3 NY /T 829-2004 附录A资料性附录)高效液相色谱圄5.00 1.00 4.00 3.00 2.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 固A.l氨节青霉素标准溶液(1glL)的色谱圈保留时间:8.308min) 1.00 5.00 4.00 3.00 2.00 0.00 。UHU nu 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 图A.2氨节青霉素标准溶液(2阿IL)的色谱图4 NY /T 829-2004 5.00 的也N.4.00 3.00 2.00
11、AU AV l AV H hu 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 氨节青霉素标准溶液(10阿IL)的色谱图图A.35.00 3.00 2.00 ov nu l 0.00 4.00 14.00 12.00 空白牛奶试样的色谱图4.00 图A.42.00 0.00 5.00 4.00 2.00 0.00 3.00 1.00 5 14.00 6.00 8.00 10.00 12.00 空白牛奶添加试样(1附IL)的色谱图4.00 圈A.52.00 0.00 NY IT 829-2004 5.00 4.00 0.00 3.00 2.00 1.00 1
12、4.00 12.00 10.00 空白牛奶添加试样(2阿IL)的色谱固8.00 6.00 4.00 固A.62.00 0.00 -m 5.00 4.00 3.00 2.00 0.00 1.00 14.00 12.00 10.00 空白牛奶添加试样(10问IL)的色谱圈8.00 6.00 4.00 固A.72.00 0.00 6 附录B规范性附录)添加回收试验NY /T 829-2004 精密量取4.9mL离心后的空白牛奶，置于10mL塑料离心管中，加入0.1mL氨韦青霉素标准品溶液，使成最终浓度为2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL的添加试样，旋涡混匀30s后，静置10min。按测定步骤(4.4.2-4.4.4)相同的操作进行测定。7 叮CON-ONH问Z中华人民共和国农业行业标准牛奶中氨节青霉素残留检测方法-HPLC NY IT 829-2004 9奄中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9夸争等争舍关* 字数8千字2005年1月北京第1次印刷印数:12 000册定价:8.00元印张0.75开本880mmx1230mm 1116 2005年1月第1版书号:16109 387 版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894 NY厅829-2004
