1、ICS 67.050 B 50 :才H中华人民共和国水产行业标准SC/T 3020-2004 水产品中己烯雌酣残留量的测定酶联免疫法Determination of diethylstilbestrol residues in fishery products Enzyme linked immuno sorbent assay 2004-01-07发布2004一03一01实施中华人民共和国农业部发布刚自本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。SC/T 3020-2004 本标准起草单位:中国水产科学研究院长江水产研究所、农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。本标
2、准主要起草人:艾晓辉、刘长征I SC/T 3020-2004 水产品中己烯雌盼残留量的测定酶联免疫法1 范围本标准规定了水产品中己烯雌酣残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酣的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/f 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，
3、加入己烯雌酣标准或样品溶液、己烯雌酣酶标记物、己烯雌酣抗体后，己烯雌酣与己烯雌酣酶标记物相互竞争己烯雌酣抗体的结合位点。结合的己烯雌酣酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测，吸收光强度与样品中的己烯雌酣浓度成反比，按校正曲线定量。4 试剂和材料本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB厅6682一级水标准。4.1 叔丁基甲基醒:色谱纯O4.2 石油醋。4.3 二氯甲烧。4.4 甲醇:色谱纯O4.5 氢氧化饷:1 mollLo 4.6磷酸:6mollL。4.7 20%甲醇的20mmollL兰提基甲基氨基甲皖(Tris)缓冲液(pH8.5) ，40
4、%、70%、80%的甲醇溶攘，此溶液现用现配。4.8 67 mmollL磷酸盐缓冲液(pH7.2) : 9 . 61 g磷酸氢二锅，1.79 g磷酸二氢饷溶解于蒸馆水，定容至1 000 mL，此溶液现用现配O4.9 己烯雌酣酶联免疫定量测定试剂盒，参见附录Ao5 仪器与设备5.1 酶标仪:波长450nmo 5.2 离心机:转速4000r/mino 5.3 氮吹仪。5.4 电热恒温水浴锅。5.5 高速匀浆机。SC/T 3020-2004 5.6 Cl8固相提取柱:长6.5cm，内径。.7cmo 5.7 固相萃取器。5.8 微型油在涡混合仪。5.9 振荡器。5.10 微量加样器:20L、50L、1
5、00L、250L、1000Lo5. 11 微量多通道加样器:50L、100L。6 样晶处理6. 1 试样提取取出鱼、虾、蟹、鳖等水产品肮肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cmxO.5 cmX 0.5 cm的小块后说匀，置冰箱中冷冻备用。将样品解冻，取5g(精确到0.01g)样品于匀浆机的玻璃管中，加10mL 67 mmollL磷酸盐缓冲液(pH7 .2)，充分匀浆，称取3g(精确到0.01g)匀浆组织于20mL玻璃离心管中，加人8mL叔丁基甲基酶，强烈振荡20min , 4 OOOr Imin离心10mi口，转移出上清液至20mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基甲基酷重复提取沉淀物
6、，将两次提取的酿相合并，70c水浴蒸发至干。取70%的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油酶洗涤甲醇溶液，游涡棍合1min , 4 000 rl mm离心1min，吸除石油膛，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲皖溶解，加1mollL氢氧化饷溶液3mL，游涡振荡后静置，取出上层氢氧化铀溶液，加入6mollL磷酸300L中和提取液，用CI8固相提取柱进一步纯化。6.2 样品纯化将C18固相提取柱垂直固定，用3mL无水甲醇洗涤柱子，再用2mL20%甲醇的20mmollL T ris缓冲液(pH8.5)平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化铀提取液用1000L微量加样器全部加入柱中，过柱，
7、然后用2mL20%甲醇的20mmollL Tris缓冲液(pH8.5)洗涤柱子，接着用3mL40%的甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以干燥柱子。用2mL 80%的甲醇洗脱样品(以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴Is左右，可用固相萃取器抽真空控制)，收集洗脱液，向洗脱液中加人2mL水，取20L进行酶联免疫测定。7 酶联免疫测定检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好(参见附录A)。控制室温至20C-24C，取出足够数量的微孔条插入微孔架中，加入20L的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部，记录各标准液和样品的位置，标准和样品做两个平行实验。每个微孔
8、中加人50L稀释后的己烯雌酣抗体，微旋振荡j昆合，置2C -8C冰箱中孵育20ho 取出微孔架，因复到室温20C-24C ，洗板(甩出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。用250L蒸铺水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次), 加入50L稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分棍合后，置室温孵育1h，再洗板后(间上述洗板方法)，每个微孔中加入50L基质和50L发色试剂，充分i昆合，并在室温暗处孵育30min，每个微孔中再加入100L反应停止液，混合后在60min内测量并记录每个微孔450nm处的吸光度值。8 结果计算8. 1 计算相对吸光度值计算每个
9、己烯雌酣标准液和样液的平均吸光度值，按公式(1)求出己烯雌酷标准液和样液的相对吸光度值。2 SC/T 3020-2004 Ri=Ai/AoX 100 . (1) 式中:Ri一一相对吸光度值，单位为百分比(%); Ao一一空白标准的吸光度值;Ai -标准或样品的平均吸光度值。8.2 绘制校正曲线以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以己烯雌酣浓度的对数为横坐标，绘制出己烯雌酣标准液相对吸光度值与己烯雌酣浓度的校正曲线(参见附录B)，校正曲线在0.05glLO.4glL范围内应当成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酣浓度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。8.3 结果计算在8.2绘制的
10、校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酣浓度乘以相对应的稀释系数(本标准所采用的稀释系数为4)，即为试样中的己烯雌酣残留量。9 检测限、回收率9. 1 检测限本方法的检测限为0.6glkgo9.2 回收率本方法的回收率二三70%。3 SC/T 3020-2004 附录A(资料性附录)己烯雌酣酶联免疫定量测定试剂盒A.l 己烯雌酣酶联免瘟定量测定试剂盒己烯雌酣测定试剂盒由德国R-Biopharm公司制造1)，可用于肌肉、尿、胆汁、粪便及肝脏中的己烯雌酣残留检测。试剂盒应保存在2C-8C的干燥避光环境中，并在有效期内使用，试剂变质应当弃掉2)。所有试剂应达到室温20C-24C后使用。每个试剂盒包
11、括:1X框架，96孔板(12条X8孔)包被有兔抗己烯雌酣的抗体(兔IgG抗体)。6X标准液(1.3mL/瓶)，为40%的己烯雌酣甲醇水溶液:0周IL、0.025问IL、0.05glL、0.1g/L、0.2glL、0.4glLolX己烯雌酣过氧化物酶标记物浓缩液(0.7mL) 0 lx己烯雌酣抗体浓缩液(0.7mL)。1x酶基质(7mL):含有过氧化服。lx发色剂(7mL):四甲基联苯胶。lx反应停止液(14mL): 1 mol/L硫酸。1x缓冲液(25mL)。A.2 己烯雌酣酶标记物的稀释用试剂盒提供的缓冲液以1:11的比例，在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用(由于稀择
12、的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物)。A.3 己烯雌酣抗体的稀释用试剂盒提供的缓冲液以1: 11的比例，在玻璃试管中稀释抗体浓缩液，轻轻地振摇，充分氓匀后使用(由于稀释的抗体稳定性不好，所以只稀释实际需用量的抗体)。1) 德国R-Biophann公司生产的巳烯雌勘测定试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这-信息是为了方便本标准的使用者，并不排除运用同等性能的其他产品。2) 发色试剂有任何颜色，表明发色剂己变质;空白标准的吸光度值小于0.6个单位(A450 nm 0 . 6 )时，表示试剂可能变质。4 SC/T 3020-2004 附录资料性附录)己烯雌酣的标准曲线B 100 9
13、0 80 70 60 50 40 30 20 10 O 法-gHm棋时E灰黑0.4 0.2 l hv 0.05 0.025 己烯雌盼浓度.llglL己烯雌酣的标准曲线5 圄B.1叮gN|ONO的Hum 中华人民共和国水产行业标准水产品中己烯雌酣残留量的测定酶联免疲法配/T3020-2004 争e中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销关争夺争夺开本880mmX1230mm 1116 印张0.75字数7千字2004年2月第1版2004年2月北京第1次印刷书号:16109.302 印数:11 000册定价:8.00元关法版权专有僵权必究举报电话:(010) 65005894 sc厅3020-2004
