1、ICS 67.050 B 50 人共和-7 4 本东SC/3021-2004 7 CI 自由会录残留谱法的测Determination of malachlte green residues in fishery products High-performance of liquid chromatography 2004-0个07发布2004 -03-01实施中人民共和巨型农业部发布本标准附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出c目可吕本标准起草单位:中国海洋大学、国家水产品质量监督检验中心。本标准主要起草人:林洪、李兆新、玉联珠、江洁、邱续建、李晓)11 0 SC/T
2、3021-2004 I SC/3021-2004 水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法1 范围本标准规定了水产品中孔雀石绿和元色孔雀石绿残留量的液相色谱测定方法。本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的检测c2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/r 6682 分析实验室用水规梅和试验方法3 术语和定义3.1 3.2 下列术语和定义适用于本
3、标准孔雀石绿malachite green 属于三苯甲烧染料类，分子式为CnH25ClN2，绿色结晶体c注:孔雀石绿的结构式见附录A无色孔雀石绿leucomalachite gr臼nN，N-工申基苯肢，孔雀石绿在水生生物体中的主要代谢产物，分子式为CnH26N2c注:无色孔雀石绿的结掏式见附录Ac4 原理以乙酸胶盐溶液和乙睛提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿后，经过液-1夜萃取，回相萃取，用接有氧化柱的C18柱进行高效液相色i普分析，外标法定量5 试剂5.1 所有试剂应无干扰峰，应选择优级纯或色谱纯的试剂，分析纯试剂应重蒸。5.2 孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品:孔雀石绿纯度二三90%，元色孔雀
4、石绿纯度关90%。5.3 乙睛:色谱纯。5.4 二氧甲烧:分析纯。5.5 盐酸起股溶夜:0.25g/mL 5.6 二甘醇:分析纯c57 乙酸镣溶液:0.1mollL(pH4.5) ,0.125 mollL(pH4. 5)0 5.8 对甲苯磺酸溶液:0.05mollI 5.9 碱性氧化铝:分析纯，粒度0.071口立n-0.150mmc 5.10 中性氧化铝:分析纯，粒度0.071口1m-0.150 mmc 5.11 丙基磺酸阳离子树脂:PRS(propylsulfonicacid) ,40 J.m二SC/T 3021-2004 5.12 孔雀石绿标准溶液:准确称取孔雀石绿0.1000g，用乙腊梅
5、解，定容于100mL容量瓶中，使成浓度为1mg/mL的标准洛液，再用乙睛稀释成0.1g/mL的工作。溶液乞该溶液应避光保存c5.13 无色孔雀石绿标准悔?夜:准确称取无色孔雀石绿0.1000g，用乙精溶解.定容于100mL容量瓶中，使成浓度为1mg/mL的标准;容;夜，再用乙腊稀释成O.l，u.g/mL的工作榕液。该溶液应避光保存。5.14 工氧化铅:分析纯c5.15 硅藻土:精制工业硅藻土c5.16 水:应符合GB/T6682的要求c6 仪器6.1 高效液相色谱仪:配可变波长检测器c6.2 电子天平:感量0.0001go 6.3 匀浆机36.4 离心机。6.5 振荡器c6.6 旋转蒸发器。6
6、.7 固相萃取柱:PRS柱，中性氧化铝柱。6喃8色谱柱:C18柱c6.9 柱后氧化柱:柱内填料:二氧化铅硅藻土=1:107 操作方法7.1 样品处理7.11 取样鱼去鳞、皮，沿背脊取胆肉;虾去头、壳，取可食肌肉部分;蟹、甲鱼等耳又可食部分。所取样品切为不大于0.5cmXO.5 cmxO.5 cm的小块后说匀二7.1.2 称取样品10g-20 g(精确到O.OOlg)，置于匀浆杯中，向杯中依次加3让J盐酸进股海液、5mL对申苯磺酸溶液和20mL O. 1 mollL的乙酸镣搭液，匀浆2min，转移到250mL三角瓶中，用60mL乙睛洗涤匀浆杯，洗涤;液夜合并至型到i甘j三角;瓶缸中，加人2却Og
7、碱性氧化铝，用振荡器振荡5min，转移至4支5到OmL离心管内，3到Om孔lL乙睛洗涤三角瓶后转移到离J心仨管中，400o1/min离d心L1臼5m丑11117恤2分离纯化7.2.1 液一液革取7.2.1 . 1 将离心管上清液移入分歧漏斗中，向离心管中加入乙脯，洗涤，离心(4000r/min, 15 min) ，合并上清液到分液漏斗中，并加入100mL水、50mL二氯甲镜和:2mL二甘晖，剧烈振摇分液漏斗，静置1 ho 7.2.1.2 用蒸发瓶收集下层液体后，再往分液漏斗力日人50mL二氧甲:境，振摇，静置约10mi丑，待其分层后收集下层液体于同一蒸发瓶c将收集;夜在35C下i成压旋转蒸发(
8、注意:开始时温度不要直接升到35C ，以免爆沸)至体积约2mL-3 mL 7.2.2 国相柱萃取7.2.2.1 回相柱制备采用中性氧化铝(1g)、PRS填料(0.5g)分别装填两只因相萃取柱，按中性氧化铝柱在前、PRS柱在后的顺序将两柱串联二7.2.2.2 上样7 SC/T 3021-2004 使用前用5mL乙睛预洗两柱，然后将7.2.1.2浓缩被体加入5mL乙睛氓匀后，缓慢加入中性氧化铝柱内(注意:不要引起柱表面填料浮动0)再用5mL乙腊洗涤蒸发瓶两次.两次洗涤液均加入柱内，最后用5mL乙睛洗涤两柱c7.2.2.3 洗脱收集弃去中性氧化铝柱，用2mL水洗PRS柱，洗脱液弃去;加入0.5mL乙
9、睛:乙酸镜溶液(0.1mol!L, pH4. 5 ) = 1 : 1 ，洗脱液弃去;再加入2mL乙腊:乙酸按海液(0.1mol儿，pH4.5)工1:1，收集该洗脱组分，定容到2mL，经聚四氟乙烯膜(孔径。.45m)过滤，待上机分析7.3 样品测定7.3自1测定条件7.3.1.1 色谱柱:C18柱，250mmX4.6 mmj柱后氧化柱:35 rrm1 X 4. 6 n肌7协3.1.2流动相:乙睛:乙酸镀溶液(0.125mol!L, pH4 .5) = 80: 20 j流速:2mL/mino 7.3.1.3 柱温:35C。7.3缸1.4进样最:50I-Lo7.3.1.5 检测波长:588 l1l1
10、1或618l1l11 0 7.3.2 色谱分析分别注入50L浓度为0.1g/mL的孔雀石绿溶液、无色孔雀石绿工作溶液及样品提取溶液于液相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内c根据标准样品的保留时间定性，外标法定量c标准品色谱图见附录Bo8 结果8.1 计算样品中孔雀石绿、无色孔雀石绿的含量按公式(1)计算c式中:x= AX 一-AsX m X 1000 无一梓品中孔雀石绿(无色孔雀石绿)含章，单位为微克每千克(glkg)j Cs一一标准溶液中孔雀石绿(元色孔雀石绿)含量，单位为微克每毫升(l-g/mL)j A一-试样液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的
11、峰菌积;V一一样品提取物溶液体积，单位为毫升(mL)jAs-一标准降;庭中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的峰面积;m一一样品重量，单位为克(g)c8.2 方法阳收率本方法的回收率注70%0 8.3 方法栓19!限本方法检测限:孔雀石绿为2glkgj元色孔雀石绿为4glkgo8.4 批间方法变异系数本方法变异系数15%8.5 方法的线性范围. (1) 本方法的线性范围:孔雀石绿标准液0.01问ImL-0.40问ImLj无色孔雀石绿标准液0.02g/mL-0.40g/mLo 叫J SC/T 3021-2004 附录A(资料性附录)孔雀石绿和无色孔雀石绿的结构式门 3C0个|十/CH3 H C 因A，l孔雀石绿(盐酸盐)结构式/ 飞、/爪H飞C11曰11CH句U叫、/乒/，/ :T :T CH3 CH3 因A2元色孔雀石绿结构式4 SC/T 3021-2004 甜录B(资料性附录)孔雀石绿和无色孔雀石绿标准品的液相色i营商一mAU 15 GMUMUm 115 0.75 0.5 0.25 。一0.25盯lln6 4 MG:孔雀石绿;LMG:无色孔雀石绿7 。3
