1、ICS 11.020 c59 备案号:17596-2006 明TS中华人民共和国卫生行业标准ws 258-2006 黑热病诊断标准Diagnostic criteria for kala-azar 200604-07发布2006-12-01实施咛=t#主川、民主主是采IlffiLl主组三茜庐发布废。ws 258-2006 前言本标准是在GB15986-1995(黑热病诊断标准及处理原则的基础上制定的，GB15986-1995作本标准的附录B、C是规范性附录，附录A、D是资料性附录。本标准由全国地方病寄生虫病标准委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部挝准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心寄
2、生虫病预防控制所，新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，四川大学。本标准主要起草人z汪俊云，管立人，柴君杰，李雄，王雅静。黑热病诊断标准1 范围本标准规定了黑热病的诊断依据、诊断原则、诊断标准和鉴别诊断。本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对黑热病的诊断。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 黑热病kala-azar ws 258-2006 又称为内脏利什曼病Cvisceralleishmaniasis) ，是由趋内脏的利什曼原虫寄生于人体所引起的一种寄生虫病。我国黑热病的病原体有杜氏利什曼原虫CLeishmar归d01wvani)和婴儿利什曼原虫CL.infantum) 两种
3、。2.2 无鞭毛体amastigote和前鞭毛体promastigote 利什曼原虫在其生活史中有两种形态，一是寄生于人和哺乳动物单核巨噬细胞内无运动能力的无鞭毛体，虫体呈卵圆形，鞭毛不伸出体外。另一为寄生于白蜡消化道内或在培养基内生长的有运动能力的前鞭毛体(promastigote)，常呈梭形，较元鞭毛体大，鞭毛自虫体前端伸出。3 诊断侬据3. 1 流行病学史(参见附录A)黑热病流行区内的居民，或曾在59月白蛤成虫活动季节内在流行区居住过的人员。3.2 临床表现长期不规则发热，盗汗，消瘦，进行性牌大，轻度或中度肝大，全血细胞减少和高球蛋白血症，或有鼻出血及齿由民出血等症状。3.3 实验室检测
4、3. 3. 1 免疫学检测下列任何一种免疫学方法检测结果为阳性者(见附录B)。3.3.1.1 直接凝集试验(DAT)。3. 3. 1. 2 间接荧光抗体试验(IFAD。3. 3. 1. 3 rk39免疫层析试条法CICT)。3.3. 1. 4 酶联免疫吸附试验CELISA)。3.3.2 病原学检查(见附录。在骨髓、脾或淋巴结等穿剌物涂片上查见利什曼原虫元鞭毛体，或将穿刺物注人三恩氏CNNN)培养基内培养出利什曼原虫前鞭毛体。4 诊断原则根据流行病学史、临床表现以及免疫学检测和病原学检查结果予以诊断。5 诊断标准5. 1 疑似病例:应同时符合3.1和3.205.2 临床诊断病例:疑似病例并同时符
5、合3.3.101 ws 258-2006 5.3 确诊病例:疑似病例并同时符合3.3. 20 6 鉴别诊断(参见附录D)黑热病应与播散性组织胞浆菌病、马尔尼菲青霉菌病以及恶性组织细胞病(恶性组织细胞增生症)相鉴别。2 ws258一2006附录A(资料性附录)流行病学、凰治区。冲华人民共和国成立后，经过、四川、陕西、山西和内蒙古等6省(区)病要媒什F主。利。削。童染蛤阳型儿感自制源的为大都犬内原山以染历。岁传亚蛤呻J组Jhfh们3 ws 258-2006 . 1 直接i疑集饿验. 1. 1 抗原制备附录B(规范性附录)免疫学检测. 1. 1. 1 在4C以1800r/min离心10min收集培养
6、的利什曼原虫前鞭毛体。. 1. 1. 2 收集的前鞭毛体以冷的洛克民液(0.25%葡萄糖，0.9%NaCl, O. 04% KCl, O. 02%磺酸铀)4C下1500r/min离心10min洗5次。B.l. 1. 3 按前鞭毛体压积量1: 20的比例加入0.4%膜蛋白酶洛克民被(pH7.7)，充分悬津前鞭毛体后于37C孵育45mino1 500r/min离心10min，沉淀按前述方法洗5次。B. 1.1. 4 以降的洛克民班悬津前鞭毛体，并调整其密度至2X 108 /ml，再加等体积岭的2%甲醒-梅克氏液，置4C过夜。B. 1. 1. 5 4C下1500r/min离心10min，用冷的拧攘酸
7、盐榕被(8.77g NaCl，16.46g拧穰酸三铀，双蒸水榕解并定容至1OOOml ,pH7. 4)洗后再用拧撵酸盐晦液悬浮井调整其密度至lX108/ml，. 1. 1. 6 加考马斯亮蓝至终被度0.1%，搅拌90min.1 500r/min离心10min，沉注用拧攘酸盐溶液洗2tX后再用含0.4%甲醋的拧攘酸盐禧液悬潭，并调整原虫密度至1X 108/时，置40C下避光保存(不应冷冻)。. 1. 2 检测方法B.1.2.1 取V叫U)形孔的微量板进行编号。B. 1. 2. 2 用含1%胎牛血清和0.1mol/L伊琉基乙醇的拧穰酸盐榕液按1: 100稀释度稀释待检血清，37C孵育30minoB
8、. 1. 2. 3 对于12列的徽量板，除第二孔外每孔均加入50l稀释液(含1%胎牛血清的拧攘酸盐梅液)。. 1. 2. 4 加上述稀释的血清100p.1于第2孔并棍匀，再从第2孔转移501至第3孔，昆匀后再从第3孔取50l至第4孔，依此类推，直至第12孔，棍匀后从第12孔吸去501，在同一板中分开设置阳性和阴性血清对照孔。. 1. 2.5 轻摇上述制备的抗原以重新悬潭前鞭毛体，取50l抗原至各孔，首先加第1孔元血清对照孔)，其股力日第12孔，再次是第11孔，依此1jY!序加至第2孔。B. 1. 2. 6 盖上盖板，依次按顺时针和逆时针方向稍稍晃动微量板1min以混匀抗原和血清，室温水平放置过
9、夜。B. 1. 2. 7 置微量板于白纸上或置光盒上，由上向下观察。由两人强立观察并记录结果。B. 1. 2.8 深蓝色斑点大小等同于无血清抗原对照孔斑点大小者判为阴性;深蓝色斑点大于无血清抗原对照孔斑点者判为阳性，阳性阔值应注1: 1 600(血清稀释度。B.2 间接荧光抗体试验一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血。且2.1 抗原片1 800r/min离心15min收集经三恩氏培养基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛体，弃上清液，沉淀加生理盐水棍匀，向法离心洗海3次后，用含0.2%福尔马林的O.Olmol/L pH7. 2的磷酸盐缓冲液CPBS)固定，置冰箱内lh后取出，
10、同法离心，弃上清，沉淀再用PBS搅涤一次。收集的虫体用PBS稀释至前鞭毛体lXl04/m1，取10p.1 i亥稀释液;由于玻片上事先画好的圈内，吹干。此抗原片用4 ws 258-2006 锡?自纸包装密封后可置一200C冰箱中保存备用。B. 2. 2 干血滴的制备t在滤纸上面1.2cm直径的圆圈，在圈内滴人2滴(相当于201)病人耳垂血，晾干后放人装有干燥剂的塑料袋内，密封井置冰箱保存待用。B.2.3 取血清用pH7.2的PBS进行稀释，起始稀释度为1: 20，再作倍比稀释至1: 320或1: 640。当用滤纸干血作检测时，从滤纸上剪下干血滴，加O.2mL o. 01mol/L pH7. 2的
11、PBS浸泡，置冰箱内过夜，第二天取出，用pH7.2的PBS进行倍比稀释。B.2.4 取抗原片吹干，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴于抗原片上，置湿盒内于370C温育30min后，用pH7.2的PBS缓慢漂洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS漫泡10min，继续用蒸锢水漂洗一次，吹干。B. 2. 5分别滴加1: 10稀释(或按产品要求的工作浓度进行稀释的荧光标记抗人IgG，置湿盒内于370C温育30min，如前清洗，吹干待检oB.2.6 检查时在玻片上加甘油水溶被一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。以荧光的亮度强弱
12、判定阳性的强弱。能清楚看到前鞭毛体，显示微弱荧光者记为十飞中等亮度者记为十十，强烈耀眼荧光者记为+十+, 界于后二者之间者记为十十十。B.2.7 每次试验均以确诊的黑热病病人血清或干血滴浸泪液和正常人血清或干血滴浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1: 20稀释时亦偶可出现十，故以十十为阳性标准，井以1: 20(即1: 20 十+)为最低阳性稀释度。B.3 rk39免疫层析试条法B. 3.1 将试剂和待测样品置室泪平衡。B.3.2取出试条井水平放置，加20i待测血清或40l全血于试条的样品垫上，待液体吸收后再在样品垫上滴加3滴试剂盒中配备的缓冲液，10min内观察结果。B.3.3 当试条出现
13、两条带时，不论其强弱即判为阳性，若仅出现一条带则为阴性，若无任何条带出现则表明试条失效。B.4 间接ELISAB.4. 1 利什曼原虫前鞭毛体可、溶性抗原的制备培养和收集利什曼原虫前鞭毛体，40C下用无菌O.01mol/L pH7. 2的PBS洗3次后，按前鞭毛体的压积量加40倍体积的无菌蒸锢水，在液氮和370C水浴中，反复短暂冻融5次，然后在冰浴中超声粉碎(15s，5次), 15 OOOr/min 40C离心20min，上清即为可榕性抗原。B.4.2操作方法B. 4. 2. 1 以pH9.6的碳酸盐缓冲破(1.59g Na2C03, 2. 93g NaHC03，加蒸锢水溶解并定容至1U稀释的
14、上述制备的抗原包被96孔酶标板，每孔1001C每孔抗原量为1g)，40C过夜。B. 4. 2. 2 以PBS-T (PBS-O. 5 %吐温)缓冲液洗涤3次，用含5%脱脂奶粉的PBS潜液370C封闭30min B. 4. 2. 3 同法用PBS-T缓冲液洗涤3次后每孔加入用PBS按1: 50稀释的人血清样本100p.l (同时设3孔阴性和1孔阳性对照孔)，370C孵育30minoB. 4. 2. 4 PBS-T洗涤后加人用PBS按工作放度稀释的抗人IgG辣根过氧化物酶结合物，每孔1001，37C孵育30minoPBS-T洗涤。B. 4. 2. 5 TMB底物系统的配制溶液A.四甲基联苯腊(TM
15、B)200mg加元水乙醇100ml静解，加双蒸水定容至1000ml。播液B.磷酸氢二铀14.饨，拧棱酸9.33g, O. 75%过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水榕解并定容至1000mt调pH至5.0。将播液A和溶液B按1: 1的比例混合即为TMB底物系统。5 WS 258-2006 B.4.2.6 按100ul/孔加TMB底物系统，37C孵育30minoB.4.2.7 加2512mol/L H2504终止反应。在酶标仪上以450nm波长读取OD值。B.4.2.8 结果判定:P/N注2.1为阳性cp-待测样本OD值，N-阴性对照平均OD值)。6 ws 258-2006 附录C(规范性附录)病原学
16、检查巳1瞎骨穿刺巳1.1 病人侧卧，露出带骨部位，用手指确定懦骨上棘，将该处及其周围皮肤用腆酒及酒精消毒，行局部麻醉。骨穿剌针，年龄较大的儿童及成年叫来菌。C. 1.2 穿刺针的大小视病人人用16号穿刺针，所用穿刺针.-，C. 1. 3 以髓骨前上棘后约Ld800角，穿过皮下组织及食用.!t.，1 内。C. 1.4按病人明针尖己人骨髓腔射在玻片上制成战c. 1.5 骨髓涂C. 1.6 涂片染吉氏母液3滴，C. 1. 7晾干后摇形，大小为3m黯制较小但着色更元鞭毛体才能判nC.2 脾脏穿剌，使其与水平线成700，._动作将针尖钻人骨髓腔稳当放手后针不斜倒，表剌针拔出，将骨髓自然干燥。l，或在2m
17、l水中加圆个现卵一发或和有形核没回胞而呈细野体勒制红上需队以一个巳2.1 C. 2. 2 巳2.3巳2.4C. 2. 5 C. 2. 6如ml或1叫在数目蜡知ltlf小JL用7号针头战灭时A针头)，右手持穿刺针刺人腹壁，令患者暂停呼吸，助于协助固定慨脏帮他通?哺唤向上、生M括方向与腹璧呈400交角刺人脾脏中，快速抽吸数次至抽出少量红巳2.7用无菌纱布压迫，迅速拔出针头撤回撒州呀眼用帖膏固定，用多头腹带紧束腹部。将穿刺物涂片，染色镜检(见C.1.6，C.1.7)。C. 2. 8 术后最初2小时每20分钟测脉搏1次，30分钟测血压1次，如无变化可每小时测1次，共4次。巳2.9术后卧床24小时后方可
18、下床活动。巳3淋巴结穿刺C. 3. 1 一般均选择腹股沟部位的淋巴结作穿刺，其他部位的淋巴结如肿大，亦可用作穿刺。C. 3.2淋巴结肿大处经局部消毒后，用洗净的左手拇指和食指捏住一个淋巴结，向上提起，并使其固7 ws 258-2006 定于两指之间。注意穿刺部位不得污染。右手取高压1肖毒过的7号针头(配10m!注射器)，先穿过皮肤，然后剌人淋巴结内，抽吸数次。C. 3. 3 将针头内的淋巴组织被射在玻片上制作涂片。由于所获的被体量甚少，做涂片时应仔细。C. 3. 4 涂片染色镜捡:见C.1. 6,C. 1. 70 C. 4 三恩氏培养基的制备琼脂14.饨，氧化饷6.饨，蒸情水900时，置烧瓶中
19、加热熔化，分装试管，每管3m!。经高压蒸气灭菌，待稍冷却后每试管加人1ml去纤维兔血，均匀棍合后斜置待冷。冷却后每管加入O.5ml洛克民溶液，40C冷藏备用。C. S 原虫培养在严格元菌操作下，把抽吸到的骨髓或淋巴液注入三恩氏培养基内，置220C240C温箱内培养，15天后用白金耳取少量培养鞭置显微镜下检查，如查见利什曼原虫的前鞭毛体即可确定惨断。8 D. 1 播散性组织胞浆菌病附录D(资料性附录)鉴别诊断ws 258-2006 该病临床表现与黑热病极相似，患者大都发生在南方诸省、区，临床表现有肝、脾大，发热，贫血，白细胞和血小板减少，体重下降等症状和体征。组织胞浆菌也寄生于巨噬细胞内，涂片中
20、观察到的病原体形态也与利什曼原虫无鞭毛体极相似。但可从以下特征进行鉴别z组织胞浆菌较利什曼原虫无鞭毛体稍大，外膜较厚，菌体内无特定构造，也无动基体类似结构。组织胞浆菌在染色后因胞壁收缩而在菌体周围出现一层未着色的空晕。可用真菌培养法或组织胞浆菌皮内试验来确定诊断。D.2 马尔尼菲青菌病该病在我国南方的广东、广西、湖南、香港诸省(区)都有发生，患者有发热、肝牌大和贫血等症状，常被误诊为黑热病。但播散性马尔尼菲青毒菌病常有咳嗽等肺部症状，X线透视可见肺部有炎性阴影，白细胞常增多，有时在体表可发生丘痒、结节和服肿，皮损可自行愈合。在骨髓、淋巴结穿剌物涂片上可见在巨噬细胞内大量菌体聚集成桑甚状或葡萄串
21、状，菌体内无一定结构。D.3 恶性组织细胞病(恶性组织细胞增生症)该病多见于青少年，男性多于女性。临床表现极为复杂，主要有持续不规则发热、乏力、消瘦、衰竭，红、白细胞减少，同时伴有肝、脾和淋巴结肿大，黄瘟和皮房等。血涂片上有时可查见异常组织细胞。骨髓涂片上可见异常组织细胞，以及吞噬有红、白细胞的巨噬细胞，这些对本病有重要诊断价值。患者的病程大都为6个月至1年，病死率极高。9 COON-的NEF国华人民共和卫生行业标准黑热病诊断标准WS 258一2006中出版发行:人民卫生出版社(中继线010-67616688)地址:北京市丰台区方庄芳群园3区3号楼邮编:100078 网址:http:/ E-mail: 购书热线:010-67605754 010-65264830 印刷:北京新丰印刷厂经销:新华书店开本:880X1230 字擞:23千字版次:2006年11月第1版书号.14117.60 定价:9.00元版权所有，侵权必究，打击盗版举报电话:010-87613394 (凡属印装质量问题请与本社销售部联系退换)即张:1 2006年11月第1版第1次印刷骨1/16
