1、C50 :豆豆J同.;、己目厦1 WS/T 121一1999 匕曰B Guidelines for the immuno-turbidimetric determination of serum apolipoprotein , and apolipoprotein B 1999-12 -09发布2000- 05 - 01 发布 中华人民共和国卫生行业标准血清载脂蛋白A，及载脂蛋白B免疫透射比浊测定法WS/T 121-1999 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045电话，68522112中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版权专有不
2、得自印 开本880X12301/16 印张1/2字数9千字2000年6月第一版2000年6月第一次印刷印数1-1000 睡标日411-59itH 前WS/T 121-1999 本标准以卫生部医政司编写的t全国临床检验操作规程第二版(997)中所列载脂蛋白A，和载脂蛋白B测定方法为基础，并参考美国国家临床实验室标准委员会批准的载脂蛋白免疫测定法准则(NCCLS文件l/LA15-A.1997)而制定。本标准从2000年5月l日起实施。本标准由卫生部医政司提出。本标准由卫生部北京老年医学研究所负责起草。本标准主要起草人z李健斋、王抒、国汉邦、唐蔚青。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。I
3、i L j 中华人民共和国卫生行业标准清载脂蛋白，A，及载脂蛋白B免疫透射比浊测定法Guidelines for the immurto-turbidimetric determination 。fserum apolipoprotein A, and apolipoprotein B 1 范围1 WS/T 121-1999 本标准规定了测定血清载脂蛋白A，和载脂蛋白B的免疫透射比浊测定法.本标准适用于临床与基础医学实验室做我脂蛋白A，和载脂蛋白B免疫透射比浊测定，亦可作为生产厂商生产载脂蛋白儿和载脂蛋白B免疫透射比浊测定试剂盒的标准.2测定原理本法血清中的载脂蛋臼A，或我脂蛋臼B分别与试剂中
4、的特异性羊(或兔)抗人载脂蛋白A，或抗人载脂蛋白B抗体相结合，形成不溶l性免疫复合物，使反应液产生混浊，浊度高低反映血清样品中载脂蛋白A，或载脂蛋白B含量，后者可由校1住血清所作剂量-响应曲线算出。3 免疫原及抗血清的制备3. 1 免疫原(抗原)的制备| 3. 1. 1 从混合新鲜人血清中提取免疫原.3. 1. 2 提取抗原用的人血清必须包括人群样品中载脂蛋白A，、载脂蛋白B的各种抗原决定位点，包括各种表型的位点变化。I3. 1. 3 我脂蛋白A，从超速离心1IilJ备的人血清高密度脂蛋白提取，用凝胶过滤、离子交换层析或高效液中目色i古技术提纯，所得纯载脂蛋白A，不得含有高密度脂蛋白中的其他载
5、脂蛋白.特别是载脂蛋白A应达到免疫纯。，3. 1.4 载脂蛋白B抗原用超速离心法市IJ备密度在.030-, 050 g/mL部分的低密度脂蛋白.3. 1. 5 载脂蛋白A，及载脂蛋白B抗原必须新鲜制备，在一20.C以下冰凉保齐。在贮存中有潜在的丧失抗原位点的危险.避免反复冻融。|注g提纯的载脂蛋白B分子不可逆地聚合.丧失抗原决定位41.故只能用纯低密度脂蛋白作免疫原。3. 2 抗血泊的制备3. 2. 1 用于免疫比浊测定的载脂蛋白A，、载脂蛋臼B抗体为兔抗人或羊抗人血清(多克隆抗体。3.2.2 抗血清特异性2应用双相免疫电泳和免疫印迹法鉴定抗血清，要与人血清主要蛋白质及其他载脂蛋臼无交叉反应.
6、3. 2. 3 抗血济效价g用琼脂双向扩散法测定，中问孔加正常人血清(载脂蛋白A】或载脂蛋白B浓度1 g/L左右)0.01mL.环绕四周的在巾分别加不同稀释度(如1 2.1 : 4.1 : 8.1 16 .1 32.1 : 64 . . )的抗血消0.01mL。载脂蛋白A，抗血i奇效价应不低于16.载脂蛋白B抗血泊效价应不低于12803. 2. 4 载脂蛋白A，抗血清应对高密度脂蛋白各亚型、载脂蛋白B抗血清应对极低密度脂蛋白、中间中华人民共1999-12-09批准2000 - 05 -01实施1 一一一一一一WS/121-1999 密度脂蛋白、低密度脂蛋白及其各亚型都有反应。3- 2. 5 抗
7、血清外观应澄清。3.2.6 抗血清的保存2加入适盐防腐剂的抗血清在冰冻条件下(-70C)保存三年。一般情况下经过纯化或处理的抗血清应用液保存时间不宜过长。4 I主1 9 M 载脂蛋白B有8-100!j日-48之分，因为B-48是B100分子氨宋捕的部分，所以用多克隆抗体只能测且我脐蛋白B.除非己证明所用抗血济对我脂蛋白B-48元交叉反应。单克隆抗体特异性币、纺于纯化，但需作严格的鉴定与选tf以了解tt对仔在于不同脂蛋白中的同种报昕蛋内的抗原位点是否都能起反应，对纯化的载脂蛋白A，与低密度脂蛋白R再与自然状态存在的载脂蛋白A，与我脐蛋白B同样起反应.对载1日茧白的各种亚型是否一样起反12.受检者
8、的准备及样品的采取4. 1 受检者准备应让受试者做如下准备2a)取血前两周保持平时饮食习惯gb)近期内无急性病、外伤、手术等异常情况;c)取血前数天至数周停用影响血脂的药物，否则记录用药情况:d)取血前24h不饮酒、不做剧烈运动;e)取血前禁食12h; f)除卧床患者外，取血前至少静坐5mino 4.2 取血方法取前臂静脉血，止血带的使用不超过1min，避免溶血。4. 3 取血次数应以1周以上2月以内的时间间隔对同一受试者取血2-3次。4.4 血清的处理和贮汗4.4.1 一律用血清iFl定4.4.2 血液佯品采取后在室温自T:30-40 min令其自行凝固，3h内离心分离血清。样品如不能当日完
9、成测定，在4C保存不超过4天，-20C以下保存6个月，-70C可存数年。冰冻与融化只能1-2次。J幸存中应尽量避免融化。5 仪器和设备免疫透射比浊法须用配有波长340nm滤光片的光度汁或分光光度汁。为检测大批样品，宜用全自动或半自动生化分析仪。使用于工操作的光度计及半自动分析仪者，还应配备高精密度的稀释器及加样器。光度计吸光度读数的精密度在1.0A时应在士0.002A以内。稀释器移液的精密度应在土0.3%以内，加样器应能准确加佯小至2L.6 测定操作6. 1 安全措施血清样品和来源于血液的参考物质、质控物质、校准物质有可能含致病微生物，须避免吞入或与皮肤接触。6.2试剂6.2.1 样品和f释齐
10、IJ:宜用pH7.0-7. 4的缓冲液，内含适垃聚乙二醇6000及表面活性剂，试剂本身的吸光度应小于0.05(340nm)，在4C冰箱中可存放1年。此液无色透明，如发现吸光度升高，应抽滤后2 WS/T 121-1999 用。|6.2.2 抗血清应用液:将纯化的抗血清用不含表面活性剂的缓冲液稀f手。抗血泊的稀将度应白抗血清效价而定.稀释后的抗血清稳定性差，应加入稳定剂以延长保存其(囚商品而异)。6.2.3 校准血清见本标准第7章参考物质。6.3 对测定方法的要求i 6. 3. 1 应用免疫比浊法测定载脂蛋白A1、载脂蛋白B时必须去除血清加样品稀释剂的空白:X数.故在手工或半自动操作中不能用单一试
11、剂法，而以双试剂为宜。用自动分析仪时在加入抗血y，f后用网点法测定。，6.3.2 每批测定都必须做剂最响应由线(56点定标)。开1)l-响应曲线的载脂茧臼A1、载脂蛋白B浓度范围应在0.42.5g/L。校准血清我脂蛋白A，浓度宜在1.4g/L左右，我脂蛋白B浓度宜在j, 0 g/L左右，可在作不同倍数千币释后用。如能配备35份校准血泊则更好，其载脂蛋白A1与我脂蛋臼B浓度范回可在0.6g/L至2.0g/Lo 6. 3. 3 血清样品用量z血清样品最好用稀释液在稀释(如1: 20或1 100)后测定.反应总体积500L时，测载脂蛋白A1的血清最适用:!1:为0.5L1L，i则我脂蛋白B可用3L5
12、L。如血清不经稀将而直接测定，在反应总体积为500IJ时，测载脂蛋白A1血清用岳不得超过3L.测载脐蛋白B血清用虽不得超过5L，还须具备准确加怦(2I，L5L)的设备.6.3.4 测浊度的波长选用340nm，有的仪器用双波长者可按仪器说明书操作-6. 3. 5 反应温度应在20C以上。6.3.6 加抗血清后的反应时间，手工操作中以30min为终点，用自动分析仪时可根据反应进程确定i主取终点时间，一般810min为宜。6.3.7 方法的不精密度与不准确度在使用自动分析仪时不得超过5%，手工操作时不得超过10%。6.4 干扰因素6.4.1 样品混浊2轻度混浊可以用我面活性剂及减去空白读数而得以校正
13、。乳庶微粒血症可将血清放置冰箱中过夜，吸出液面的奶油样层如血i青仍显混浊，应作高迷离心至清澈。必要时可改用放射免疫或酬免疫法损他| 6.4.2 反向免疫反应=血清样品中可能含有对动物抗血泊中某些蛋白的抗体，如遗传性免疫球蛋白A缺乏患者血清中常有动物免疫球蛋白M戎乳蛋白抗休。人血济中的类风i显因子可以与动物免疫球蛋白起反应，操作者应注意到这些特殊悄况的出现。6.4.3 基m效应:基质效应是指样品基质的物理、化学变化对被分析物测定值的影响。在我脂蛋白测定中.分析新鲜样品用新鲜的参考血消时，不出现基质效应。但用多次冰冻融化的、冰冻干燥的或在制备中增添某种外加成分的参考血清，在某些分析系统中(不是所有
14、的分析系统)其反应不同于新鲜血清，使样品测定结果引起偏差。所以我fliJ蛋白测定中要注意选用合适的分析系统及与样品基质十分相似的参考物质.以避免这种性质不明的干扰。|7 参考物质7. 1 一级参考物质我脂蛋白A1测定用提纯的载脂蛋白人，载脂蛋白B测定用新鲜制备的低密度脂蛋白(d=1.030 1. 050 g/mL)，其蛋白质含盐用十二烧基硫酸纳盼试剂(Lowry氏)法或氨基酸组成分析法测定，以美国国家标准与技术研究所的牛血清白蛋白(NISTNo. 927)为参考标准。此项工作由参考实验室负责。7.2 国际参考物质: 已由世界卫生组织与国际临床化学会(WHO-IFCC)合作制得第份载脂蛋白A1与
15、我脂蛋白B国际参考物质.载脂蛋白A1参考物质(SPI-0l)是加有稳定剂冻干人血清，载脂蛋白B参考物质(SP3-07)白白白FWS/T 121 1999 FNF H民是加有稳定剂的液态人血清，证明这两份血清的基质效应不明显。参考物质的载脂蛋白定值依据一级参考物质，载脂蛋白A，由双抗体放射免疫法测定，载脂蛋白B用免疫光散射法1m)定。7.3 次级参考血清次级参考血清的定值均应按WHO-IFCC的要求由国际参考物质准确转移，使其定值的准确性可溯源于国际参考物质，我国己有定值转移成功并获得证书的实验室可提供定值的参考血清，是同一份液态血清有载脂蛋白A1与载脂蛋白B定值。参考血请在4C只能保存1-2天
16、，-20C可保存6个月，一70C充氮保存可稳定3年。7.4 商品试剂盒用校准物7.4. 1 规定用混合人血清并力求新鲜。除适量抗菌物质与稳定剂外，不添加其他成分。7.4.2 校准血清用安部分装(每支1-2mL)后封口，-20C冰冻保存，1)由用前取1支或数支，融化并充分混匀后，当天使用，剩余弃去。同一份血消有载脂蛋白A1与载脂蛋白B定值。如载脂蛋白A1校准物用冻干血清，必须试验在复溶后与冻干前的血清比较有无基质效应。7.4.3 校准血清必须准确定值。应对照次级参考血清，以试剂盒所配备的试剂及符合要求的抗血清作靶值转移，使采用该试剂盒及其校准物时，其准确性可溯源于国际参考物质及次级参考血清。7.
17、4.4 稳定性(见7.3)理II定数据处理与报告8 8. 1 血清样品与参考物用量在最适范围(参见6.3.3)且反应体系中有足够的特异性抗体时，我脂蛋白A，、载脂蛋白B在0.4-2.5g/L时，剂量-响应曲线基本t成一直线.但会有一定截距，故应以回归方程汁算结果。8.2 血清不经稀释直接进行测定时，剂量响应曲线往往呈S形，须用适当方法进行直线化转换。常用的计算方法是logit-log变换，即Y坐标为浊度读数的logit，X坐标为分析物(抗原)浓度的对数。logitYlnY/(100-Y)J。也可用其他的曲线拟合方程计算。8.3 载脂蛋白A1及载脂蛋臼B的测定值以g/L或mg/L报告。不得翻印版权专有* 书号，155066 2-12871 钟标目411-5。
