1、ICS 11.020 c50 备案号:15862-2005 明TS中华人民共和国卫生行业标准WS/T 246-2005 白细胞分类计数参考方法Reference leukocyte differential count method 2005-05-08发布2005-12-01实施叶I圭t主川、民E主是不口IliLI主组主苦口发布WS/T 246-2005 前为了保证白细胞分类计数结果具有溯源性和准确性，特制定本标准。本标准修改采用了美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁发的白细胞分类计数参考方法和仪器评价方法标准CH20-A)。本标准从2005年12月1日起实施。本标准的附录A、附录
2、B和附录C都是规范性附录。本标准由卫生部提出。本标准由上海市临床检验中心负责起草。本标准主要起草人:胡晓波、许营、宋颖、方心驰、张锦锋。本标准由卫生部负责解择。WS/T 246-2005 白细胞分类计数参考方法1 范围本标准规定了建立白细胞分类计数参考方法中有关样本采集、血涂片制备的要求、血涂片染色、血涂片有核细胞检查的步骤、对检验人员的要求和考核等内容。本标准适用于白细胞分类计数参考方法的建立。2 总则2. 1 本标准采用于工目视显微镜计数法作为白细胞分类计数的参考方法。2.2 为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验室必须进行比对。3 方法3. 1 样本采集将静脉血采集
3、于EDTA-K2抗凝剂(液体或粉末状)中(撒度为每毫升血被含1.52. 2mg EDTA K2 H20)。采血后立即混匀，应拒绝分析有肉眼可见凝块的样本。3.2 血涂片制备和要求3. 2. 1 血涂片制备3. 2. 1. 1 每份样本制作3张血涂片。要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为25mmX75mm，厚度为O. 8- 1. 2mmo井有明确标记。如果样本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片(如6张)。3.2. 1. 2使用EDTA-K2抗凝血掖样本时，应在采集后4小时内制备血涂片。在制片前，梓本应充分棍匀。注意，样本不能冷藏。3.2. 1. 3 用棋形技术制备血涂片。在玻片近一端1/3处，
4、加一滴(约0.05ml)充分泪匀的血液，握住另一张较狭窄的、边缘光滑的推片，以300-45。角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至玻片的另一端(图1)。血涂片尾部，血涂片体部的涂片太薄检查区域血涂片头部，涂片太厚州州脂血膜至玻片一端约为总长1/3K卢OOH血膜至玻片边缘约5mm红细胞分布较疏红细胞分布较密圈1外周血涂片制作方法和城垛式血涂片检查方法l WSjT 246-2005 3.2. 1. 4 在1小时内，用Romanowsky类型染液染色:或在1小时内，用无水甲醇(含水量80/6 10 7 50 2 2 7 WS/T 246-2005 C. 2. 2标签每个样本应有唯一编码，检验
5、人员不得知道样本来惊。但应做好i己录，以便能从样本编码中了解患者的病史。C. 3 试验操作C. 3. 1 参考方法必烦由实验室内具备资格的检验人员操作。C. 3. 2 仪器必须事先校准，每天进行质控删试，并保留校准和质控记录。C. 3.3 每位患者取2份血被样本分别用于参考方法和仪器法的测试。若评估图像分析原理的仪器，应按照厂商说明书要求制备血涂片和染色。若评价流式细胞术原理的仪器，按照厂商说明书要求运行仪器。C. 3.4 研究样本应统一标记c如参考方法，血涂片标记为A、B和备用;图像分析方浩，血涂片标记为C、D和备用;流式细胞术方法，按照厂商说明书的要求。C. 3.5 保存样本来自草和全血细
6、胞计数的结果记录。C. 3.6 每天准备每种方法所需要的样本。C. 3. 7 用参考方法进行分类计数时，每份患者样本分析400个细胞，由两位具备资格的检验人员，按照参考方法步骤，对每张血除片分析200个细胞。其中，一位检验人员使用血涂片A，另一位检验人员使用血涂片Bo记录结果，数据必矫表明每张血涂片编号和检验人员。C. 3.8 仪器法至少对200份样本进行双份测定。每天样本处理量不要超过研究总量的25%0测定细胞总数至少是400个，但不同仪器间实际计数量不同，流式细胞术原理的仪器通常检测几千个细胞。记录测定的实际细胞数量。C. 3. 9样本应覆盖正常和异常全部计数范围。为了便于统计分析，在仪器
7、没有将杆状核作为独立参数报告时，杆状核计人中性粒细胞总数中。C.4 数据来集C. 4. 1 采集不准确度数据C. 4.1.1 用参考方法计数时，使用玻片盒(或架)放置血涂片，采取随机化模式排列，便于随机分析。另一个盒子用于放置巳完成检验的血涂片。由具备资格的检验人员使用参考方法得出参考值。每份样本的每张血涂片(A或B)必须由一位检验人员检验，同一检验人员不得检验同一份样本的第2张血涂片。C.4. 1. 2 每份样本的分类计数结果登记在数据汇总表上(表C.2)。表C.2不准确度数据记录表势样参考方法XA+XB持畴仪器法Yc+Yv 本白细胞总数淋巴细胞计数CX)4 淋巴细胞计数(Y)*特2 号瑾片
8、A :殴片B均值王班片C玻片D均值。)注2特建立每种细胞类型评价的表格;HXA和XB各计数200个细胞户H如果采用流式细胞术，但需测定样本(，在C和D中填人相同结果C. 4. 1. 3 保留仪器原始打印条和登记数据，并与参考方法记录一一对应。C. 4. 1. 4 记录所有样本白细胞总数，计算仪器法和参考方法的均值。C. 4.2 采集不精密度数据8 C. 4. 2. 1 采集短期不精密度数据C.4.2.1.1 短期不精密度是使用C.2所述样本，在同一批次中每份样本测定两次。C. 4. 2. 1. 2 计算仪器法或参考方法的短期不精密度。汇总数据见表C.30C. 4. 2. 2 采集长期不精密度数
9、据WS/T 246-2005 C.4.2.2.1 长期不精密度是通过测定一段时间内，每天使用质控物在仪器上反复分析某种类型细胞，得出标准差和变异系数。质控物通常由厂商提供。C.4.2.2.2 长期不精密度估计也可通过收集一段时间内配对样本的结果获得。实验室每周对4份样本进行双份分析，然后，纵向比较周与周之间的结果，也能得出不精密度数据。汇总数据见表C.3 0 表C.3短期和长期不精密度短期长期细胞类型均数cv 均数。J中性粒细胞淋巴细胞单核细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞C.5 临床性能研究C. 5. 1 参考范围的建立临床验证一种方法时需要依赖参考范围。若仪器法和参考方法结果不完全相同时，更需要
10、建立每种方法的参考班围。临床性能判断与参考范围有关，而与仪器法和参考方法之间的偏倚无关。C. 5. 1. 1 健康个体研究中需要100名健康个体。本标准中，健康个体的定义为zC. 5. 1. 1. 1 元已知影响白细胞分类计数的临床疾病和临床表现;C. 5. 1. 1. 2 最近无上呼吸道感染;C. 5. 1. 1. 3 全血细胞计数中其他成分如血红蛋白，红细胞压积，红细胞计数和臼细胞计数应在下列参考市围内(见表c.的。C. 5. 1. 1. 4 实验室工作人员、门诊定期随访患者和经选择程序确认的患者，符合上述标准的，可视为健康个体。也可采用献血前的献血员样本。亵C.4血液学参考范围(不包括自
11、细胞分类)女A性男性百分位数5% 95% 5% 95% 血红蛋白量(g/L)113 151 131 172 Hct(L/L) 0.335 0.450 O. 380 O. 508 红细胞数(X1012/L)3.68 5.13 4.09 5.74 白细胞数(XW/L)3. 69 9.16 3. 97 9. 15 1 注:数据摘自:丛玉隆，金大鸣，王鸿利，等.中国人群成人静脉血细胞分析参考施围调查.中华医学杂志，2003，83(14) : 1201-1205 巳5.2临床性能的试验9 WSjT 246-2005 C. 5. 2. 1 试验方法从临床实验室工作中选择所有样本，至少连续两周，并考虑来自各
12、种专科门楼和住院患者的样本。而且，对于仪器法来说，必须考虑实验室会遇到的最严重疾病，应选择特殊的异常病例(见表C.1)。样本数量越大，结果的可靠性越大。C.5.2.2 仪器报警系统的性能目的是显示报警系统识别异常样本的能力。采用相同样本，比较仪器法和参考方法之间所有样本的分类结果，若结果一致，表明报警系统有效。C.5.3 根据土述试验结果，计算样本的一致率、假阳性率和假阴性事。当仪器法和参考方法结果不一致时，由仲裁者判断结果。C. 6 数据统计学分析巳6.1 方法学比较不巳6.1. 1 参考方法和仪器法的不准确参考方法的不精密C. 6. 1. 2. 1 C. 6. 1. 2. 1. 1 C.
13、6. 1. 2. 1. 2 C. 6. 1. 2. 1. 3 C. 6. 1. 2. 2 不准确其中:王为仪器法最严;俨叫r;nt = 总数(日400个)。在参考值土SrXSE范围内为C. 6. 1.2. 3 影晌因素在分析中，考虑下列影响数据的C. 6. 1. 2. 3. 1 样本间差异:生物学变异为E?;Ji虽一边卜以用仪器法和(yi) ，作出满意%可信区|司的钱血涂片A和B计数的细胞C. 6. 1. 2. 3. 2方法间固有偏倚:通过测量两种方法之间每种类型细胞的均值差异，能得到方法间固有偏f奇。C. 6. 1. 2. 3. 3非随机干扰:己知(非随机)干扰因素必须从研究数据中剔除。例如
14、，剔除中性粒细胞Pelger-Ht由异常的样本，因为这类样本使中性分叶核粒细胞减少，可使仪器法与参考方法之间结果不一致。但是，这类样本在临床性能研究中不能剔除。C. 6. 2不精度C. 6. 2. 1 短期不精密度短期不精密度是每种类型细胞作重复测定的差异。短期不精密度计算公式:10 s = 主r其中:n=样本散;dj=样本i重复计数间的差异。计算短期变异系数=主一XI00，巧1且C. 6.2.2 长期不精密度长期不精密度是用质控物作连续重复测定。长期不精密度计算公式:其中:n=样本数;Xj=第i日的计算长期变异系数=均值C. 6.2.3 不精密度结采用表C.3格巳6.311面床性能C. 6.
15、 3. 1 参考范C. 6. 3. 1. 1 根据值38的值)。C. 6.3.1.2 C. 6. 3. 2 I恼C. 6. 3. 2. 1 巳6.3.2.2成两类:分布考范围;形态异其他异常细胞，可同一患者可能常。巳6.3.2.3制巳6.3.3仲裁C. 6. 3. 3. 1 原则WSjT 246-2005 (界外值为超出均为95%健康人例按下列要求分胞计数值超出参现有核红细胞和仲裁是对仪器法和通常具有专门技术和经验，并为具备资格的检验人员，分类计数工作。C. 6. 3. 3. 2 仲裁方法巳6.3. 3. 2. 1 对所有参考方法和仪器法不同的结果，核查制片是否良好，染色是否可接受，有元誉写错
16、误。C.6.3.3.2.2 对于形态不一致(1)判断2张参考血涂片为何种异常，核查仪器法结果，确认有无形态报誓。(2)如果有一位检验人员发现异常，浏览2张血涂片，确认有元形态异常。(3)如果仪器法有形态异常报警，但是检验人员未发现形态异常，应仔细削览2张血涂片，确认2位检验人员有无漏报。C.6.3.3.2.3 对于分布不一致11 WS/T 246-2005 (1)用参考方法对每份样本进行重新分析(若有可能，用仪器法进行重新分析)，观察是否每次分析XlZ.份结果差异大于方法预期的不精密度。(2)如果参考方法结果的差异超出预期范围，再进行200个细胞分类计数，并与原始结果进行比较。如果仲裁者计数结
17、果与2份原始结果之一符合，即在可信区间内，但和另一位检验人员结果不一致，则采用仲裁者计数结果，重新评价临床性能。若仲裁者计数在原始2份计数结果的中间，则用原始计数结果。(3)如果仪器法双份测定结果之间的差异超出了预期范围，槽查该结果，确认有无因样本异常所致的仪器故障，使分类计数结果无效。若仪器吐为形态异常，应从分布分类表中剔除该数据。C.6.3.3.3 修正用仲裁结论修正分布和形态分类表。C. 6. 3. 3. 4 不一致性作为分类表的补充，准备不一致结果的清单，包括样本数和不一致原因(如第63号样本参考方法发现原始细胞，仪器出漏报0)C. 6.3.4 判断临床准确性根据分布和形态分类衰，计算
18、仪器法和参考方法之间的致率，假阳性率和假阴性率。分布和形态分类表仪器法结果阳性(异常)阴性(正常)参考方法阳性(异常)TPC真阳性)FNC假阴性)阴性(正常)FP(假阳性)TN(真阴性TP+TN 一致率(%)=TP+FArl打nl中;:rXI00，pp 假阳性率(%)=pp丰币XI00，FN f自阴性率C%)=p百平TFX100012 的OON-寸NH由旨dF匮华人民共和卫生行业标准自细胞分类计数参考方法WS/T 246 - 2005 中印张:1. 25 2006年5月第1版第17X印刷* 出脑发行:人民卫生出版社(中继钱67616688)地址:(100078)北京市丰台区方庄芳群园3区3号楼网址:http:/阴阳.pmph. com E mail: 即，IjlIJ:北京新丰印刷厂经销:新华书店开本:880 x 1230 字数:34千字版次:2006年5月第1版书号.14117 . 9 定价:9.00元著作权所有，请勿擅自用本书制作各类出版物，违者必究(凡属印装质量问题请与本杜销售部联系退换)1116 ws汀
