1、中华人民共和国卫生行业标准全血胆碱自旨酶活性的分光光度测定方法瓷肢三氯化铁法Blood-Determinatoin of cholinesterase activity-Spectrophotometric method-Hydroxylamine-ferric chloride method 1 主题内容与适用范围WS/T 66-1 996 本标准规定了血中胆碱醋酶活性的分光光度测定方法一一短胶三氯化铁法。本法最低检测浓度为2.4mol/L。本标准适用于正常人和接触有机磷农药人员血中胆碱醋酶活性的测定。2 原理血液胆碱醋酶使乙酷胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱醋酶水解而剩余的乙酷胆碱与碱性起胶
2、反应，生成乙酷程股，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色起月号酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酷胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酷胆碱的量计算胆碱醋酶活性。3仪器3. 1 分光光度计，10mm比色杯。3. 2 比色管，10mL。3. 3 普通漏斗，40mm。3.4 恒温水浴箱，控温:J:0.5C。3. 5 采血针头。3. 6 血色素吸管，有20L刻度。4 试剂本标准所用试剂均为分析纯试剂。4. 1 实验用水，蒸榴水或具同等纯度的去离子水。4.2 盐酸，zo=1. 19 g/mL。4.3 盐酸溶液0+2)。4.4 碱性起胶溶液，临用前将139g/L盐酸起股溶液和140g/L
3、氢氧化锅溶液等体积1昆合。4. 5 磷酸盐缓冲液(pH=7.20)，准确称取磷酸氢二饷(NazHP04 12HzO) 8. 36 g和磷酸二氢饵(KHzP04) 1. 36 g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内。4.6 三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeC13 6HzO) ，加0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中。4. 7 氯化乙酷胆碱标准液，精确称取乙酷胆碱1.271 6 g，用磷酸盐缓冲液(4.5)溶解，并稀释到100 mL，此溶液1mL相当于70mol乙酷胆碱，为贮备液。临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液(4.5)稀中华人民共和国卫生部1996-10-1
4、4批准1997-05-01实施WS/T 66-1996 释10倍，此榕液1mL相当于7mo!乙酷胆碱，为应用液。5 采样、运输和保存5. 1 用血色素吸管，取耳垂血20L.注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液).立即进行测-吨，/J三。5.2 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL.注入玻璃管中(含肝素或草酸饵抗凝剂).混匀。于保温瓶中加冰运迭，置于4CC冰箱中可保存一周。6 分析步骤样品测定按下表进行。全血胆碱醋酶测定操作步骤佯品管对照管标准管空白管磷酸盐缓冲液.mLO. 98 0.98 1. 0 1. 0 I昆匀全血(草酸御抗凝).mLO. 02 0.02 置37C水浴中预热5mi
5、n 乙酌胆碱应用液(4.门.mL1.0 1.0 水.mL1. 0 1.0 置370C水浴中反应30min.准时取出，各管加入4.0mL碱性泾胶溶液(4.的，充分振摇2min.继续加入2.0mL盐酸溶液(4.3).充分振摇2min.再加入2.0mL三氯化铁溶液(4.的，充分振摇，用滤纸过滤后，以试剂空白为参比在波长520 nm处测吸光度。然后按7.1计算胆碱醋酶活性。如同时分析大批样品，可采用标准曲线法按7.2求出胆碱酶酶活性绝对值。7 计算7. 1 公式计算法7. 1. 1 按式(1)计算酶活性的绝对值。x. _十B-A-, -:. -X7 ( 1 ) C 式中:X笛一一水解乙酷胆碱的浓度，m
6、o!(O.02 mL 3TC 30 min); A 以试剂空白为参比的在被长520nm处样品管的吸光度值pB一一以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值;C一一以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。7.1.2 按式(2)计算酶活性的相对值。y=主X100 式中:y一一酶活性的相对值.%;X, 被测血样中酶活性的绝对值，mo!(O.02 mL 37C 30 min); Xc一一正常人血中酶活性绝对值，mo!(O.02 mL 37 C 30 min)。7.2 标准曲线法7.2.1 被水解乙酷胆碱的吸光度=c一(A-B)。 ( 2 ) WS/T 66- 1996 7.2.
7、2 被水解乙酷胆碱的吸光度查乙酷胆碱标准曲线，得相应的被水解乙酌胆碱(mol)。此值是0.02 mL血液在37C30 min反应条件f，胆碱醋酶的活性绝对值。8 说明8.1 本法检测限为2.4mol/L，线性范围为2.41 000.0mol/L。当乙酷胆碱的含量为1.4 , 4. 2, 7.0mol时，其变异系数分别为:12.8% , 9.0% ，6.4%。8. 2 使用的玻璃器皿洗净后，在1+3硝酸中浸泡24h，用水冲烧干净后，再用蒸馆水洗兰次，干操后备用。8. 3 取血时不应过度挤压耳垂，因为本法是同时测定血清假性胆碱醋酶和血球真性胆碱酶酶。选用的乙酷胆碱基质浓度对血球真性胆碱最适宜，此时
8、测得的血液胆碱酶酶活性值，真性胆碱醋酶占85%。测定结果基本上只代表血球真性胆碱醋酶活性值。如果采血时过度挤压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例过多，会使结果偏低。8.4 加碱性是股和盐酸(1+2)时，必须严格掌握振摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。8.5 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪色，必须控制在20min内比色完毕。若大批样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液，否则会有较大误差。8.6 滤液一定要澄清，如果出现提出，会使吸光度升高，而胆碱醋酶活性偏低。8. 7 氧化乙酷胆碱基质不太稳定，每次测定需做标准管。标准管读数在同一比色计上应保持恒定或仅有较小的变动。8.8 计算胆碱醋酶活性百分数时，应以本地区正常人全血胆碱醋酶活性为基准。附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由辽宁省劳动卫生研究所负责起草。本标准主要起草人周健英、胡素清。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所负责解释。
