1、中华人民共和国国家标准GB 15193-12 94 体外哺乳类细胞CV79/HGPRT）基因突变试验V79/HGPRT gene mutation test 1 主题内容与适用范围本标准规定了体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变试验的基本技术要求。本标准适用于需要进行食品安全性评价的用作或用于食品的化学物质。2 原理细胞在正常培养条件下，对6-TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制次黄嚓岭鸟嚓岭磷酸核糖转移酶（HGPRT）的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继
2、续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。3材料和试剂3- 1 细胞z使用中国仓鼠肺（V79）细胞株。为了减少自发突变率，正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT座位突变体选择性杀灭，方法是将野生型细胞接种于含次黄嗦怜及胸腺略睫，氨甲蝶岭，甘氨酸的MEM培养液中培养1周，然后重新接种于MEM培养液中。3- 2 培养液z采用MEM(Eagle）基础培养液或DMEM培养液，补以10%小牛血清及适量抗菌素（青霉素，链霉素）。3-3磷酸缓冲液（无钙、缓PBS)磷酸二氢梆（KH,PO,)磷酸氢二销（Na,HPO, 12H,O) 氯化饵（KC!)氯化饷（NaCl)双
3、蒸水高压消毒，121，O.103 MPa, 20 min。200 mg 2- 89 g 200 mg 8. 0 g 1 000 mL 3-4 膜蛋白酶EDTA溶液g用无钙、钱PBS配制，膜酶的浓度为O.05% ,EDTA的浓度为o.02%，膜蛋白酶与EDTA溶液按1 1 混合。20贮存。3, 5 受试物：最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚矶（DMSO），其浓度应低于O.5% (V /V）。3- 6 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对！照物，例如甲基磺酸乙酶（EMS），丝裂霉素C(MM口，甲基硝基亚硝基肌（MNNG），苯并（a）花（BP）等。3. 7 6一TG用。5%碳酸氢销溶
4、液配成1.0 mg/mL,4贮存。3-8大鼠肝匀浆s9混合物，按Ames试验程序制备。4 实验步骤4. 1 细胞准备将5XlC个细胞接种于直径为100mm平皿中，于37，5%二氧化碳培养箱中放置中华人民共和国卫生部199408 10批准1994 08一10实施578 . GB 15193.12 94 24杠。4.2 接触受试物吸去培养液，PBS淡两次，加入无血清培养液及一定浓度的受试物需代谢活化者同时加入大鼠肝匀浆S-9混合物） l辈子培养箱中2h，绪束后吸去食受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养1922h “ 4.3 表达3接触受试物的组施继续培养1922h
5、 ti苦用旗离EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10%血清培养液终生消化，混匀，放入离心苦苦以8001000 r/min的速度离心57min，奔去上清液，illJIll(;缀胞悬液，计数，以5x105个细胞接种子直径为lOOmm的平皿，3d后分传一次，仍接种5105个细胞培养3队4.4 细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37，5%二氧化碳条件下培养7d，窟定，Giemsa染色，计数每Jlll.集落数，以相对于溶剂对照组部集落彩成率表示组施毒害泼，即以溶剂对照的集苦奋形成率为100%(1.白的，求出各检品试验兹的极对筐。A（%） X 100 . ( 1 ) 式
6、哼：A一一程对集落形成率zB一一试验级集落形成率5C一一溶剂对照组集落形成事。4. 5 突变体的选择及集落形成幕的测定：表达结束后消化细胞，分种，每组5个Jlll.，每皿种21O个细胸，待细施贴壁j后加入6-TG，终浓度为5月mg，放入培养箱续养8lOd后固定，Giemsa染色，统计每疏集落数，并计算突变率e同时另做集落形成蒜瓣定，每主直接种200个缀施，不主u6G，每经5个豆豆，7d k牙固定染色，计算集落形成率。E-F 一D . ( 2 ) 式中：D一一集落形成至在；E 实际存浓的细胞集落数pF一一接种细胞数。4-6计算H 1 G = - I D . ( 3 ) 式中，G一一突变旦在；H一
7、突变集落数I一一援手中级施数zD一一集落形成率。5 结果判定5. 1 若llll住对照中，集落形成率饺子50%，结果夜不予采用毒5.2 各实验室选用的阳性对照突变率有一定范酶，若受试物的续采为阴性或弱院住时，限性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则纷果不能成立。5. 3 当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上，或至少在3个浓度范围内突变感有随浓度递增而升高的剂量重反应关系时，百rJ句j为限性。579 GB 15193. 12-94 附加说明z本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人冯继农、高荒。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。580
