1、ICS 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准GB 15193. 12-2003 代替GB15193. 12 1994 体外哺乳类细胞（V79/HGPRT)基因突变试验V79/HGPRT gene mutation test 2003-09-24发布中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会2004-05-01实施发布81 GB 15193. 12-2003 前吉同本标准全文强制。本标准代替GB15193. 12 1994体外哺乳类细胞CV79/HGPRT）基因突变试验。本标准与GB15193. 12 1994相比主要修改如下2在“范围”中增加了受试物的具体内容z食品生产、加工、保
2、藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。自本标准实施之日起，GB15193. 12一1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位g中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：冯继农、高荒。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。82 GB 15193. 12-2003 体外哺乳类细胞CV79/HGPRT）基因突变试验1范围本标准规定了体外哺乳类细胞
3、（V79/HGPRT）基因突变试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。2原理细胞在正常培养条件下，对6TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和或致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制次黄瞟岭鸟瞟吟磷酸核糖转移酶（HGPRT）的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6TG的选择性
4、培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，汁算突变率以判定受试物的致突变性。3 材料和试!fl!3. 1 细胞z使用中国仓鼠肺（V79）细胞株。为了减少自发突变率，正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT座位突变体选择性杀灭，方法是将野生型细胞接种于含次黄嗦岭及胸腺田野院、氨甲喋岭、甘氨酸的MEM培养液中培养1周，然后重新接种于MEM培养液中。3.2 培养液z采用MEM(Eagle）基础培养液或DMEM培养液，补以10%小牛血清及适量抗菌素（青霉素、链霉素）。3. 3 磷酸盐缓冲液（无钙、读PBS)磷酸二氢押（KH,PO,) 磷酸氢二销（Na,HPO, 12日，0)氯化饵（K
5、C!)氯化纳（NaCl)双蒸水高压消毒，121，0.103 MPa,20 min。200 mg 2. 89 g 200 mg 8目0g 1 000 mL 3. 4 膜蛋白酶EDTA溶液：用无钙、钱PBS配制，膜酶的浓度为0.05% ,EDTA的浓度为0.02%，膜蛋白酶与EDTA溶液按1: I混合。20储存。3.5 受试物最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚枫（DMSO），其浓度应低于0.5%（体积分数）。3. 6 阳性对照物可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如乙基磺酸酶（EMS），丝裂霉素C(MM口，甲基硝基亚硝基肌（MNNG），苯并（a）茵（BP）等。3. 7 6 TG：用0.
6、5%碳酸氢纳溶液配成1.0mg/mL,4储存。3. 8 大鼠肝匀浆S-9混合液z按Ames试验程序制备。4 操作步骤4. 1 细胞准备：将5105个细胞接种于直径为100mm平皿中，于37C、5%二氧化碳培养箱中放置24 h 4.2 接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加入无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同83 GB 15193.12-2003 时加入大鼠肝匀浆S-9混合物），置于培养箱中2h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换人含10%血清的培养液，继续培养19h22儿4.3 表达接触受试物的细胞继续培养19h 22 h后用膜酶EDTA消化，待细胞脱落后，加入含
7、10%血清培养液终止消化，混匀，放入离心管以800r/min 1 000 r/min的速度离心5min 7 min，弃去上清液，制成细胞悬液，计数，以510个细胞接种于直径为100mm的平皿，3天后分传一次，仍接种5105个细胞培养3天。4.4 细胞毒性测定将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37C、5%二氧化碳条件下培养7天，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数，以相对于洛剂对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶剂对照的集落形成率为100% (1. 00），求出各检品试验组的相对值。AC%l 100 . ( 1 ) 式中zA 相对集落形成率；B 试验组集落形成率；C一一
8、溶剂对照组集落形成率。4.5 突变体的选择及集落形成率的测定s表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿种2105个细胞，待细胞贴壁后加入6TG，终浓度为5g/mg，放入培养箱培养8天10天后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，并计算突变率。同时另做集落形成率测定。每皿接种200个细胞，不加6TG，每组5个皿，7天后固定染色，计算集落形成率。D =fr ( 2 ) 式中D 集落形成率；E一一实际存活的细胞集落数$F 接种细胞数。l-D H-I 一G . ( 3 ) 式中G 突变率pH一一突变集落数；I 接种细胞数；D 集落形成率。5 结果判定5. 1 若阴性对照中，集落形成率低于50%，结果应不采用。5.2 各实验室选用的阳性对照突变率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。5. 3 当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上，或至少在3个浓度范围内突变率有随浓度递增而升高的剂量反应关系时，可判为阳性。84
