1、ICS 65.020.30 B 44 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 14927. 1-2001 实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法Laboratory animal一Genetic monitoring: methods for biochemical markers of inbred mice and rats 2001- 08 -29发布2002- 05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国国家标准实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法GB/ T 14927. 1-2001 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:10004
2、5电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售母开本880X12301/ 16 印张lYz字数39千字2002年2月第一版2002年2月第一次印刷印数1-2000峰书号:155066 1-18072 定价13.00元网址睡科目594-533版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533G/ T 14927. 1- 2001 前本标准是对GB/T14927.1-1994(实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法的修订。本标准对近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法中的电泳结果模式图，尽量形象化，便于实验结果对照时应用。对近交系小鼠生
3、化标记检测方法中的生化位点进行调整，取消可操作性差的生化位点尿主蛋白-l(Mupl)，增加具有可操作性强、易于推广应用的碱性磷酸酶-1(Akp1)位点。增加了国标上常用的醋酶-l(Es1)生化位点。本标准对试剂名称、书写规范等进行了修订。本标准及其配套标准自实施之日起，代替GB/T14927.1-1994。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:邢瑞昌、刘双环、沈洁、李善如、自琴华、张瑞忠。本标准于1994年1月首次发布。1 范围中华人民共和国国家标准实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法Laboratory animal一Geneti
4、c monitoring: methods f or biochemical markers of inbred mice and rats G/ T 14927.1 - 2001 代替GB/T14927.1- 1994 本标准规定了对近交系小鼠、大鼠生化标记进行检测的乙酸纤维膜(板)的电泳方法及判断标准。本标准适用于近交系大鼠和小鼠任何品系。2 定义本标准采用下列定义。2. 1 生化标记biochemical marker 本标准所称生化标记是指表明遗传特征并采用生化方法识别的记号。在大小鼠中多为一些同工酶和异构蛋白。2. 2 生化遗传概貌biochemical genetic profil
5、e 本标准所称生化遗传概貌是指各种近交系多个生化遗传标记表型资料的汇总，从一定程度上反映了各种品系的遗传特征。2.3 纯合性homozygosity 本标准所称纯合性是指同源染色体的相对位置上具有相同基因的状态。近交系动物通过连续的近亲交配绝大部分的位点都具有纯合性。一个品系内任何个体间进行交配产生的后代也具有纯合性。2.4 同基因性isogenicity 本标准所称同基因性是指一个近交品系中所有个体在遗传上是同源的。因此在同一品系内任何个体间进行皮肤和肿瘤移植不被当作异己而受到排斥。如对近交系动物的基因进行检测，一个品系内不同个体的基因型完全一致。2.5 个体性individuality 本
6、标准所称个体性是指就整个近交系动物而言，每个品系在遗传上都是独特的，表现在相当广泛的特性上，如生化遗传概貌等。大多数近交品系可通过各自的生化遗传概貌相互区别。3 方法原理在大鼠和小鼠体内存在着一些同工酶和同种异构蛋白。可依据它们在特定电场内携带的电荷不同采用电泳的方法将它们区分，并根据电泳带型即蛋白质的表现型推断其基因型，建立各种近交系的遗传概貌，定期对它们进行质量监测。中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局2001-08-29批准2002- 05 -01实施GB/ T 14927. 1- 2001 4 设备和材料4. 1 常压电泳仪。4. 2 乙酸纤维素膜电泳槽。4. 3 电泳点样装置。4.
7、4 乙酸纤维素膜。4.5 乙酸纤维素板。4.6 4.C、一20C冰箱。4. 7 低温高速离心机。4. 8 振荡仪。4.9 组织匀浆器(2mL或5mU或组织匀浆机。4.10 抗凝毛细管，抗凝毛细管塞子。4. 11 抗凝毛细管离心机。4. 12 吸耳球。4. 13 小砂轮。4. 14 解剖板，手术剪，手术慑。4.15 竹慑子。4. 16 水浴锅，37C温箱。4. 17 玻璃器皿。4. 18 6 cm X 8 cm玻璃板。4.1 9 普通滤纸。4. 20 分析天平。4. 21 pHt。4.22 紫外监测仪。4.23 实验室常规用品。4.24 化学试剂英文名称(或简写)Tris EDTA Boric
8、acid Glycine HCl H202 Citrate acid Na2HPO. KHzPO. NaOH NaC2H302 Agar MgCCzH20Z)2 如lnClzPonceau S 2 中文名称三在甲基氨基甲烧乙二胶四乙酸棚酸甘氨酸盐酸双氧水拧棱酸磷酸氢二铀磷酸二氢梆氢氧化铀无水乙酸铀琼脂粉乙酸簇氯化锚丽春红-s规格A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. o
9、r. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A.R. A.R. GB/ T 14927. 1_:_2001 英文名称(或简写)CC13COOH (HO)CsHs(COOH)S03H. 2HzO Barbital Sodium barbital MgClz Na2EDTA FeC13 K3Fe(CN)6J NH40H CH3COOH Acetone Glucose- 1-phosphate Cystamine 1 , 4-dithiohreitol (DTT) 卢-naphthylacetate
10、 4-methyl-umbellifery acetat巳-Naphthyl acid phosphate D-fructose-6-phosphate Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) 卢-nicotinamideadenine dinucleotide CTPN ) N-methyl phenazinium methyl s ulfate (PMS) DL-Isocitric acid trisodium salt Glucose-1 , 6-diphosphate D-glucose-6-phosphate Glucose-6-phosph
11、ate dehydrogenase Malic acid Fast blue RR salt 5 生化标记检测方法总则5. 1 电泳样品的制备5.1. 1 血浆中文名称三氯乙酸磺基水杨酸巴比妥巴比妥铀氯化镜乙二肢四乙酸二纳三氯化铁铁氟化梆氢氧化镀乙酸丙酣葡萄糖-1-磷酸脱胶二硫苏糖醇声乙酸荼酶4-甲基散形乙酸盐-磷酸菜醋D-果糖-6-磷酸澳化甲基哇哇蓝辅酶E甲硫吩嗦酸醋异拧橡酸三铀盐葡萄糖-1，6-二磷酸葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸脱氢酶苹果酸坚固蓝RR盐规格A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A.
12、 R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. A. R. or. C. P. 进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产进口或国产以抗凝毛细管行眼眶采血术，3500 r/min，离心5min，分离血浆和血球，吸出血浆备用。5.1.2 溶血素在去除血浆的红细胞内加入蒸馆水(l:4V/1巧，振荡1min，成为红色透明液体，即为溶血素。5.1.3 组织匀
13、浆上清液颈椎脱臼法处死动物，剖腹，小鼠取肾脏l只，肝脏1叶;大鼠取肾脏1只，小肠3cm，辜丸1只，并开胸取肺脏1叶。分别加入适量预冷蒸馆水，蒸馆水与组织的比例一般为2:l(V /W)。分别用组织匀浆器匀浆。匀浆液置低温高速离心机中，以16000r/min离心30min.以吸管吸取上清液存入小试管中备用。5.1 . 4 样品保存上述制备样品均宜新鲜使用，在普通冰箱中只能保存一天，在低温冰箱中保存不超过一个月。5. 2 电泳步骤3 GB /T 14927.1- 2001 5.2.1 浸膜将乙酸纤维膜(板)轻轻浸入相应的电泳缓冲液中，浸入时应避免膜(板上出现气泡。5.2.2 点样将浸透的膜(板)，取
14、出以滤纸吸干，纤维膜面朝上，平置在点样板上，以点样器取预置在样品槽内的编号样品，在膜(板)上点样。一次点样量为0.3L，为增加膜(板)上的样品量，可重复点样，最适点样量不宜超过0.9L(三次)。5. 2. 3 电泳以铅笔在膜板上标明原点，泳动方向，迅速将膜(板搭在事先放人缓冲液的电泳槽纸桥上，盖上电泳槽，接通电源，电泳条件见本标准第6、第7二章。5. 3 染色5.3.1 蛋白染色法电泳结束后取出膜(板置入0.2%丽春红染液中，1015min后以竹慑子取出换以7%乙酸脱色直至电泳区带清晰可见。5.3.2 酶显色板法适用于乙酸纤维素膜。5. 3- 2. 1 将酶显色液(见附录B)新鲜混合。加入2%
15、热琼脂34mL，迅速混匀，均匀倒置在6cmX 8cm的玻璃板上，制成酶显色板。5. 3.2.2 电泳结束后取出膜将点样面贴在酶显色板上，注意将膜与酶显色板间的气泡排尽，但不可移动膜的位置。5. 3. 2. 3 将带膜显色板移至3TC温箱保温，直至酶区带清晰显现。5. 3.2.4 取下已显色的膜浸入5%7%乙酸中终止反应。5. 3- 3 琼脂覆盖法适用于乙酸纤维素板。5. 3. 3. 1 电泳结束后取出乙酸纤维素板。5.3.3.2 新鲜混合酶显色液(见附录B)迅速与23mL 2%热琼脂混匀，均匀倒放在水平放置的乙酸纤维素板上。5. 3. 3. 3 待琼脂冷却固定后，将乙酸纤维素板移入3TC温箱，
16、直至酶区带清晰显现。5. 3. 3.4 将乙酸纤维素板放入7%乙酸中终止反应。6 小鼠生化标记检测细则6. 1 碱性磷酸酶-1(alkaline phosphatase-1 ,Akp1 )Chr. 1 6.1.1 样品z肾匀浆，0.6L。6.1.2 缓冲液:Tris-Citrate pH8. 3见附录A(标准的附录)中A906. .3 电泳支持物:乙酸纤维膜(板)。6. 1.4 电泳条件:电压=200V，时间=40min，移动方向白负极至正极。6.1.5 染色方法:酶显色板法。6.1.6 染色液:见附录B(标准的附录)中B10。6. 1. 7 标准对照:Akpl a C57BL / 6J 快带
17、Akp1 b CBA/N 慢带6.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6.1.9 Akp1电泳结果模式图，见图1。4 GB /T 14927. 1- 2001 b a |! -一1-一一一_+A刷图1Akpl电泳结果模式图6.2 碳酸lff酶-2(carbonicanhydrase-2 ,Car2)Chr. 3 6.2.1 样品:榕血素.0.3L。6. 2. 2 缓冲液NaC2H302-EDTA pH5. 4见附录A(标准的附录中Al。6. 2. 3 电泳支持物:乙酸纤维素膜。6.2. 4 电泳条件:电压=240V.时间=40min.移动方向由正极至负极。6.
18、2.5 染色方法:蛋白染色法。6. 2.6 染色液z见附录B(标准的附录中B6。6. 2. 7 标准对照:Car2 a C57BL/ 6J 慢带Car2 b DBA/2J 快带6. 2.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6.2. 9 Car2电泳结果模式图，见图2。b a 5 + I - Car2 图2Car2电泳结果模式图6.3 肾过氧化氢酶-2(kidneycatelase ,Ce2)Chr. 7 6.3. 1 样品:肾匀浆，0.3L.6.3. 2 缓冲液:Tris-citrate pH7. 6见附录A(标准的附录)中的A306. 3.3 电泳支持物:乙
19、酸纤维素膜。6.3. 4 电泳条件:电压=200V，时间=25min，移动方向由负极至正极。6. 3.5 染色方法:酶显色板法。GB/T 14927.1 - 2001 6. 3. 6 染色液:见附录B(标准的附录)中B8.6.3. 7 标准对照:Ce2 a BALB/cJ 快带Ce2 b CBA / N 慢带6. 3. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6.3.9 Ce2电泳结果模式图，见图3。a b 一|一一一一-+Ce2 图3Ce2电泳结果模式图6.4 醋酶-l(esterase-1，Esl)Chr.86. 4.1 样品:血清，0.3L。6.4. 2 缓
20、冲液:phosphatebuffer pH7 0见附录A(标准的附录中A2。6.4.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。6. 4.4 电泳条件:电压二140V，时间=30min，移动方向由负极至正极。6. 4.5 染色方法:酶显色板法。6.4.6 染色液:见附录B(标准的附录)中B1。6.4.7 标准对照:Es1 a C57BL/61 快带Es1 b CBA/ N 慢带6.4.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6.4. 9 Es1电泳结果模式图，见图4。b a 一|一一一一-+Es 1 图.4Es1电泳结果模式图6 6.5 醋酶-3Cesterase-3,Es3)C
21、hr. 11 6. 5.1 样品:肾、肝匀浆，0.3L。GB/ T 14927. 1- 2001 6. 5. 2 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 9见附录AC标准的附录)中A7。6. 5.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。6.5.4 电泳条件:电压=280V.时间=28min，移动方向由负极至正极。6. 5.5 染色方法:酶显色板法。6.5.6 染色液:见附录BC标准的附录)中B1。6.5.7 标准对照:Es3 a BALBJ 慢带Es3 b RF/J 快带Es3 c CA/ N 最慢带6.5. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录CC标准的附录作比较。6.5.9 Es3电泳结
22、果模式图，见图5。一|一一一一-+Es3 图5Es3电泳结果模式图6. 6 醋酶-10Cesterase-10，Es10)Chr.146.6.1 样品:肾、肝匀浆，0.6L。6.6.2 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 9见附录AC标准的附录)中A706.6.3 电泳支持物:乙酸纤维板(膜。6. 6.4 电泳条件:电压=280V，时间=28min.移动方向由负极至正极。6. 6.5 染色方法:酶显色板法。6. 6. 6 染色液:见附录B(标准的附录)中B206. 6.7 标准对照:Es10 a BALB/ cJ 慢带Es10 b DBA/2J 快带Es10 c BUB/ BuJ 最慢
23、带b a c 6.6. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录CC标准的附录)作比较。6.6.9 Es10电泳结果模式图，见图6。6.7 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1(glucose-6-phosphate dehydrogenase-1 ,Gpd1 )Chr. 4 6. 7.1 样品:新鲜肾或肝匀浆，0.9L。6.7. 2 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 9见附录A(标准的附录)中A7。6.7.3 电泳支持物:乙酸纤维板(膜。7 GB /T 14927. 1- 2001 一|一一一一-+EslO Es3 图6Es10电泳结果模式图6. 7- 4 电泳条件:电压=200V，时
24、间=50min，移动方向由负极至正极。6.7.5染色方法:琼脂覆盖法。6.7. 6 染色液:见附录B(标准的附录)中B7。6. 7. 7 标准对照:Gpd1 a C57BL/6J 慢带Gpd1 b BALB/ c1 快带Gpd1 c A2G 最慢带c b a 6. 7. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6.7.9 G，户d1电泳结果模式图，见图70 -1一一一一-+铜1图7Gpdl电惊结果模式图6.8 葡萄糖磷酸异构酶-1(glucosephosphate isomerase-l ，G，il)Chr.7 6. 8. 1 样品:溶血素，0.3L。6.8. 2
25、 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 5见附录A(标准的附录中A6。6.8. 3 电泳支持物:乙酸纤维膜。6. 8.4 电泳条件:电压=200V.时间=30min.移动方向由正极至负极。6. 8. 5 染色方法z酶显色板法。6. 8. 6 染色液:见附录BC标准的附录中B3。6.8.7 标准对照:8 b a c GB/T 14927. 1- 2001 Gpil a BALB/cJ 慢带Gpil b C57BL/6J 快带6. 8.8 判断方法z参照上述对照动物读出带型后与附录CC标准的附录)作比较。6.8.9 Gpil电泳结果模式图，见图8。| |il-b a +1一一一一Gpi1 图
26、8Gpil电泳结果模式图6. 9 血红蛋白J链Chemoglobin卢-chain，Hbb)Chr.76.9. 1 样品:榕血素内加入1/4体积的烧化剂，见附录BC标准的附录)中B9，0.3L。6.9.2 缓冲液:Tris咱GlycinepH8. 5见附录AC标准的附录)中A6。6.9.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。6.9.4 电泳条件:电压=200V，时间=30min，移动方向由负极至正极。6.9.5 染色方法:蛋白染色法。6.9.6 染色液z见附录BC标准的附录)中肘。6.9.7标准对照:Hbb s C57BL/6J 快带Hbb d BALB/cJ 慢带6.9.8 判断方法:参照上述对照动物
27、读出带型后与附录CC标准的附录)作比较。6.9.9 Hbb电泳结果模式图，见图9。d 一|一-一一-+Hbb 图9Hbb电泳结果模式图9 GB/ T 14927. 1- 2001 6.10异拧穰酸脱氢酶-1和苹果酸酶-1(isocitrate dehydorgenase- 1, malic enzyme-1 , Idh1和Mod1)Chr.1 6.10.1 样品:肾匀浆以蒸馆水1: 4稀释，0.3L。6.10. 2 缓冲液:Tris-Citrate pH7. 6见附录A(标准的附录)中A306.10. 3 电泳条件:电压二200V，时间=35min，移动方向由负极至正极。6.10.4 染色方法
28、:酶显色板法。6.10. 5 染色液:见附录B(标准的附录)中B4.6. 10. 6 标准对照:Mod1 a BALB/ c 快带Modl b CBA/ N 慢带Idh1 a BALB/c 慢带Idh1 b CBA/N 快带6.10. 7 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录)作比较。6. 10. 8 Idh1和Mod1电泳结果模式图，见图10。-1一-一一-+Idh2 Mod 1 ldh 1 图10Idh1和Mod1电泳结果模式图6.11 磷酸葡萄糖转位酶-1(phosphoglcomulase一1,Pgm1)Chr. 5 6.11.1 样品:肾匀浆，0.6L。6.11.
29、2 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 5见附录A(标准的附录中A6。6.11.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。6.11.4 电泳条件:电压=200V，时间=40min，移动方向由负极至正极。6. 11.5 染色方法:酶显色板法。6.11.6 染色液:见附录B(标准的附录)中B506. 11 . 7 标准对照:Pgm1 a C57BL/ 6J 快带Pg71 b CBA/ N 慢带a b 6.11.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录作比较。. 6.11 . 9 Pgm1电泳结果模式图，见图11。6.12 转铁蛋白Ctransferrin，Trj)Chr.9 6. 1
30、2. 1 样品g血清，0.3L。6.12.2 缓冲液:Tris-Glycine pH8. 5见附录A(标准的附录)中A6.6.12.3 电咏支持物:乙酸纤维膜。10 GB/T 14927. 1- 2001 6.12.4 电泳条件:电压=200V，时间=25min，移动方向由负极至正极。 一|一一一一-+Pgml 图11Pgm1电泳结果模式图6. 12. 5 染色方法:蛋白染色法。6.12. 6 染色液:见附录B(标准的附录中B6。6. 12. 7 标准对照zTrf a CBA/ N 快带Trf b BALBIc 慢带a b 6.12.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录C(标准的附录
31、)作比较。6. 12.9 Trf电泳结果模式图，见图120 一一一-一-一|一一一一+时图12Trf电泳结果模式图7 大鼠生化标记检测细则7. 1 碱性磷酸酶-1Calkaline phosphatase- 1 ,Akp1) 7. 1. 1 样品:肾匀浆，0.3L。b a 7- 1.2 缓冲液:Tris-EDTA-Borate-MgClz pH7. 6见附录A(标准的附录)中A807. 1. 3 电泳支持物:乙酸纤维膜。7.1.4 电泳条件:电压=200V，时间=40min.移动方向由负极至正极。7.1.5 染色方法:酶显色板法。7. ,. 6染色液:见附录B(标准的附录)中BIO。7. ,.
32、 7 标准对照:11 GB/T 14927.1 - 2001 Akp1 a F334/N 两条带Akp1 b ACI 缺失一条带7.1. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录)作比较。7. 1.9 Akp1电泳结果模式图，见图13。b a 一1-一-一-+Akpl 图13Akp1电泳结果模式图7.2 过氧化氢酶(catalase,Cs1) 7.2.1 样品:溶血素，0.6L。7.2.2 缓冲液:Tris-EDT A-Borate pH8. 4见附录AC标准的附录中A5.7. 2.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。7.2.4 电泳条件=电压=250V，时间=40min，移动方向
33、由负极至正极。7.2.5 染色方法:酶显色板法。7.2.6 染色液:见附录B(标准的附录)中B8。7.2.7标准对照zCs 1 a F334/N 快带Cs1 b WKY /Ola 慢带7.2.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录)作比较。7.2.9 Csl电泳结果模式图，见图14。 b a ill-一l一一一一-+ Csl 固14Cs1电泳结果模式图7.3 醋酶-1(esterase-1 ,Es1) 7.3.1 样品z血清或小肠匀浆，0.3L。12 G/T 14927. 1- 2001 7. 3. 2 缓冲液:磷酸缓冲液pH7.0见附录A标准的附录)中A2。7. 3.
34、3 电泳支持物:乙酸纤维膜。7.3.4 电泳条件:电压=140V.时间=30min.移动方向由负极至正极。7.3. 5 染色方法z酶显色板法。7.3.6 染色液z见附录B(标准的附录)中B1。7.3.7 标准对照:Es1 a F334/ N 一条带Es1 b ACI 缺失带7.3.8判断方法z参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录)作比较。7.3.9 Es1电泳结果模式图，见图15。 国 一|一一一一-+Esl 图15Esl电泳结果模式图7.4 醋酶-3(esterase-3，Es3)7.4.1 样品:小肠组织匀浆，0.3Lo7.4.2 缓冲液:Tris-EDTA-Borate pH8
35、. 4见附录A(标准的附录)中A507.4.3 电泳支持物t乙酸纤维膜。7.4.4 电泳条件:电压=200V，时间=35min，移动方向由负极至正极。7.4.5 染色方法:酶显色板法。7.4. 6 染色液z见附录B(标准的附录)中Bl。7.4. 7 标准对照zEs3 a F334/N 快带Es3 b SHR/Ola 最慢带Es3 d WKY 10la 慢带b a 7.4.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录DC标准的附录)作比较。7. 4.9 Es3电泳结果模式图，见图1607.5 醋酶-4Cesterase-4 ,Es4) 7.5.1 样品:肾匀浆，0.3L。7. 5. 2 缓冲液
36、:Tris-EDT A-Borate pH8. 4见附录A(标准的附录)中A5。7. 5.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。7.5.4 电泳条件:电压=200V，时间=35min，移动方向由负极至正极。7.5.5 染色方法:酶显色板法。7. 5.6 染色液:见附录B(标准的附录)中B1。13 GB/ T 14927. 1- 2001 b d ll|!|! a 一|一一一一-+ 图16Es3电泳结果模式图7. 5. 7 标准对照:Es4 a SHR/ Ola 三条快带Es4 b WKY / Ola 三条慢带7.5.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录)作比较。7.5.9 Es4
37、电泳结果模式图，见图170b a 一!一一一一-+Es4 图17Es4电泳结果模式图7.6 醋酶-6，8，9 (esterase-6 , 8, 9 ,Es6 ,8, 9) 7.6. 1 样品:辜丸匀浆，0.6L。7.6. 2 缓冲液:Tris-EDTA-BoratepH8. 4见附录A(标准的附录)中A5。7. 6.3 电泳支持物:乙酸纤维板。7.6.4 电泳条件:电压=200V，时间=35min，移动方向由负极至正极。7.6.5 染色方法:琼脂覆盖法。? 6. 6 染色液:见附录B(标准的附录)中B1。7.6. 7 标准对照:Es6 带带带带带快慢快慢快F 344 / N LOU / CN
38、WKY/Ola F344/N WKY/ Ola b a b a c nhvn6nxunv ed,ocdeo EEEE 14 GB /T 14927. 1- 2001 Es9 a F344/N 慢带? 6. 8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录作比较。7. 6. 9 Es6.8.9电泳结果模式图，见图18。一|一一一一-+7. 7 醋酶-10(esterase-1 0 .Es1 0) ? 7. 1 样品:肺匀浆.0.6L。&6 &8丘s9图18Es6.8.9电泳结果模式图7.7.2 缓冲液:Tris-EDT A-Borate pH8. 4见附录A(标准的附录)中A5.7.
39、 7.3 电泳支持物:乙酸纤维膜。7.7.4 电泳条件:电压=200V.时间=35min.移动方向由负极至正极。7. 7. 5 染色方法:酶显色板法。? 7. 6染色液:见附录以标准的附录)中B1。7.7.7 标准对照zEs10 a F344/ N 三条慢带Es10 b WKY / 01a 三条快带7.7.8 判断方法:参照上述对照动物读出带型后与附录D(标准的附录作比较。7. 7. 9 Es10电泳结果模式图，见图19。a b 一l一一一一-+EsIO 图19Es10电泳结果模式图15 GB/T 14927.1-2001 8 近交系大、小鼠常规遗传监测判断标准近交系动物具有纯合性，同基因性和
40、个体性，因此送检动物每个生化标记的表型都应为纯合型;每个品系内个体间生化标记表型都应一致;经检测获得的生化遗传概貌应与原品系的生化遗传概貌相符。依据近交系小鼠大鼠生化检测标记细则完成检测并符合上述标准的近交系可视为常规遗传监测未发现遗传变异的合格品系。如果某些品系检测结果与上述标准不相符，应依据以下原则作出分析和处理。不相符的类型可能发生变异的原因处理意见多于一个位点一二近期发生遗传污染一一淘汰、重新引种杂合型|L一个位点一一近期发生遗传漂变一一再次送检多于一个位点一一早期发生遗传污染一一淘汰、重新引种纯合型I. r一个新的亚系1 二|一个位点|一一再次送检L . -.L发生遗传突变已经固定再
41、次送检时，动物应根据监测机构的要求选送。再次检测时如未发现带杂合型位点的动物，该品系可被视为合格的近交系品系，但应注明突变基因的名称，必要时参照实验动物遗传标准对品系的名称加以修定。如再次检测时仍发现带有杂合型位点的动物，该品系应予以淘汰，重新引种。16 GB/ T 14927. 1-2001 附录A (标准的附录)缓冲液配方A1 NaC2Hs02-EDT A pH5.4(用时1: 4稀释)NaC2Hs02 10.60 g EDTA 2.48 g 蒸馆水加至1000 mL A2 phosphate Buffer pH7.0 O. 5 mol / L Na2HPO. 61 mL O. 5 mol
42、 / L KH2PO. 39 mL 蒸馆水加至1000 mL A3 Tris-Ctrate pH7.6(用时1: 5稀释)Tris 12. 10 g 10%Citrate Acid 适量调至pH7.6蒸馆水加至1000 mL A4 Tris-HCl pH8.0 Tris 24. 20 g HCl O. 1 mol/L 道量调至pH8.0蒸馆水加至1000 mL A5 Tris-EDT A-Borate pH8.4 Tris 10. 90 g EDTA 0. 60 g Boric Acid 3.10 g 蒸馆水加至1000 mL A6 Tris-Glycine pH8. 5 Tris 3. 00
43、 g Glycine 14.40 g 蒸馆水加至1000 mL A7 Tris-Glycine pH8.9 Tris 5.16 g Glycine 3.48 g 蒸馆水加至1000 mL A8 T(s-EDT A-Borate-MgC12 pH7.6 Tris 1. 81 g Na2EDTA 1. 86 g Boric Acid 0.33 g MgCl2 2.03 g 蒸锚水加至1000 mL A9 Tris-Citrate pH8.3 Tris 16. 64 g Citrate Acid 4. 20 g 蒸锢水加至1000 mL 17 GB / T 14927- 1- 2001 附录B (标
44、准的附录)染色液配方B1 2%-乙酸菜酣丙酣溶液0.5 mL Fast blue RR Salt 50 mg 0.05 mol!L磷酸缓冲液(pH7.0)9.5 mL 过滤使用2%琼脂(热3 mL B2 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)3 mL 4-Methyl-Umbelliferyl Acetate丙酣溶液(饱和)道量(2滴)至出现白色沉淀2%琼脂热)3 mL 紫外监测仪下观察B3 0.2 mol/ L Tris-HCl (pH8.0) 2 mL 0.25 mol/ L Mg (C2H32)2 150L 10%果糖-6-磷酸150L 1%MTT 150L 1%TPN 150L
45、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶5IU 0.25%PMS 150L 2%琼脂(热)3 mL B4 0.2 mol!L Tris-HCl (pH8.0) 1%MTT 150L 1%TPN 150L O. 2 mol/L MnC12 50L 0. 5 mol!L苹果酸CpH8.0)600L 10%异拧橡酸50L 0.25%PMS 150L 2%琼脂(热)3 mL B5 0.2 mol / L Tris-HCl(pH8. 0) 2 mL 0.25 mol!L Mg CC2H32) 2 200L 1%葡萄糖-1，6-二磷酸20L 10%葡萄糖-1-磷酸200L l %MTT 100L l %TPN 150L 葡
46、萄糖-6-磷酸脱氢酶5 IU 0. 25 %PMS 100L 2%琼脂(热3 mL B6 丽春红-S0.40 g 三氯乙酸6.00 g 磺基水杨酸6.00 g 18 蒸馆水B7 0. 2 mol!L Tris-HCl(pH8. 0) 0.25 mol!L Mg(CzH30Z)Z 0.5 mol!L葡萄糖-6-磷酸l % MTT 0.25%PMS l %TPN 2%琼脂(热)B8 1%三氯化铁1%铁氧化饵2%琼脂(热)GB/T 14927. 1- 2001 电泳后将膜浸入3%。的双氧水中30s，再用蒸锢水漂洗2遍后贴在B6酶显色板上。的皖化剂脱胶二硫苏糖醇氢氧化锁蒸馆水B10 0.2 mol/L
47、 Tris-HCl(pH8. 0) 卢-naphthylacid phosphate 坚固蓝RR盐0.2 mol/ L MnClz 2%琼脂(热)附录C(标准的附录)常用近交系小鼠生化位点标记基因表C1常用近交系小鼠生化位点标记基因Loci Akp1 Car2 Ce2 Es1 Es3 Es10 Gpd1 Gpi1 Hbb Strain A b b a b c a b a d AKR /- b a b b c b b a d C3H /He b b b b c b b b d C57BL/ 6 a a a a a a a b s CBA/J a b b b c b b b d CBA/ OLa
48、a b b c b b b d BALB/c b b a b a a b a d DBA/ l a a b b c b a a d DBA / 2 a b a b c b b a d 615 a a b b c a b a s TAl b b b a a b b a s TA2 b a b b C a b b d Idh1 Mod1 a a b b a a a b b b b b a a b a b a a b a b a b Pgm1 a a b a a b a b b b a b 200 mL 2 mL 150L 300L 150L 150L 150L 3 mL 4 mL 4 mL 3 mL 225 mg 3 mg 50L 2 mL 2 mL 10 mg 10 mg 0. 1 mL 3 mL Trf b b b b a a b b b b b b FCON-F.hN叮俨GBfT 14927.1-2001 附录(标准的附录常用近空系大鼠生化位点标记基因D 同筒。常用近交系大鼠生化位点标记基因Loci Akpl Csl Esl Es3 Es4 Es6 E s8 Es9 EsI0 St rain F344/ N a a a a b a b a a LOU/C a
