1、GB/T 18204.10-2000 前言为贯彻执行4公共场所卫生管理条例和GB9663-9673一1996、GB16153-1996，加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准。本标准中的方法是与GB9663-9673一1996、GB 16153-1996相配套的监测检验方法.本标准第一法为仲裁法.本标准为首次发布。本标准由中华人民共和国卫生部提出.本标准起草单位z天津市卫生防疫站、中国预防医学科学院环绕卫生监测所、江苏省卫生防疫站、北京市卫生防疫站、广东省卫生防疫站。本标准主要起草人z张淑兰、陈西平、路金爽、封幼玲、高晦.34 飞J 中华人民共和国国家标准游泳池水微生物检验方法大肠群矗豆EM
2、ethods of microbiological examination for water in swimming pool 一Determinationof Coliform bacleria 1 范围本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。本标准适用于游泳池水大肠菌群的测定.2 引用标准GB!T 18204.10-20 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文.本标准出版时，所示版本均为有效.所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB!T 18204. 2-2000公共场所茶具微生物检验方法大肠茵群测定3 定义本标准采用下列定义。大
3、肠茵群coliform bacteria 指一群在36C士lC培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.第一法多管发酵法4 仪器见GB!T18204. 2-2000中第3章。5 培养基和试剂5. 1 乳糖蛋白陈培养液5. 1. 1 成分g蛋臼陈10 g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化销5g 1. 6% (V!V)澳甲盼紫乙碎洛液1 mL 蒸馆水1000 mL 三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液按上述乳精蛋白陈培养浓浓缩三倍配制。5. 1. 2 配法g将蛋白豚、牛肉膏、乳糖及氯化销置于1000mL蒸馆水中加热溶解，调pH到7.27. 4。国家质量技术监督局却-09年30批准200
4、1- 01-01实施35 GB/T 18204. 10 -20 再加人1mLl. 6%漠甲盼指示剂，充分混匀，分装到含有fJ管的试管中.1l5C高压灭菌15mn 0 5.2 伊红美兰琼脂几GB/T18204.32000中第4章第2节.5. 3 革兰氏综色浓见GB/T18204. 3-2000中第4章第4节.5.4 染色法几GB/T18204.3-2000中第4章第5节.6 推理1)性试验6. 1 在2个装有50mL三倍浓缩乳糖胞盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mLo 6. 2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖股盐培养液的试管里各加入水样10mLo 6.3 轻摇试管，使液体充分m匀，置36
5、C :l: 1 C培养箱中，培养24ho 6. 4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性:若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进-步的证实试验.7 证实试验7. 1 平板分离自推测性检验阳性管中取一接种环绩养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36C土lC培养箱培养18-24 h.观察茵落形态，典型的大肠茵群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽.7.2 复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落l或2个进行革兰氏染色，同时接种手L黯发酵智，于36C土1C培养箱中，培养24h 0 7.3 凡乳黯发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的元芽胞杆菌，为大肠菌群阳性.记下证实试验的阳性管数.查总大肠菌群(MP
6、N)检索表得出1000 mL水样中总大肠茵群的MPN值。表1总大肠菌群(MPN)检索表!吃100 mL水量的阳。1 2 位管(瓶)数10mL 7230 第二法滤腹法B 仪器8. 1 滤器。36 , GB/T 18204.10-2000 8. 2 滤膜z孔径。.45m，直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和47mm两种.8.3 抽滤设备。8. 4 元齿慑子。8. 5 其他仪器见GB/T18204.2-2000中第3章。9培养基9. 1 品红亚硫被纳培养基9. 1. 1 成分:蛋白陈10 g 醉母浸膏牛肉膏乳梯琼脂磷酸氢二何5日5g 10日10-20 g 3.5 g 元水亚硫酸纳5g 5%碱性品
7、红乙醉溶液20mL 蒸馆水1 000 mL 9. 1. 2 储备培养基的制备将磷殷氢二饵、酵母浸膏、牛肉青及蛋白JIIj;加到含有900mL蒸恼水的烧杯中，溶解后调pH值到7.2-7.4.加人琼脂加热溶解，用蒸馆水补足至1000mL.趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内.1l5C高压灭菌20min，置冷暗处备用.9. 1. 3 平皿培养基的制备将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基按1I 50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中.再按1I 200的比例称取所需的元水亚硫酸纳置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水
8、浴中煮沸灭菌lomin.用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸纳溶液，滴加于碱性品红乙醉溶液至深红色褪成淡粉红色为止.将此亚硫阪纳与碱性品红的混合液全部加入己融化的储备培养基中，并充分m匀(防止产生气泡).立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后宣冰箱内备用.此培养基于冰箱中保存不宜超过两用，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。9.2 乳糖蛋白陈培养浓见5.1.10 操作步骤10. 1 滤膜灭菌将滤膜放入含蒸馈水的烧杯中，煮沸灭茵三次，每次15min，前两次煮沸后需更换水洗涤2-3次，以除去残留榕亦IJ, 10.2 滤器灭茵z用121C高压灭菌20mn或用点燃的酒精棉球火焰灭菌.10
9、 3 水样过滤s用无菌银子央取灭茵滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在滤床上.固定好滤器，将100 mL水样(如水样含菌数较多，可减少滤水样量或将水样稀释)注人滤器中，打开滤器阀门，在一O.5 XI0Pa(-O.5大气压)下抽滤。10.4 培养:水样滤完后.再抽气约5s.关上滤器阀门.取下滤器.用灭商银子夹取滤膜边缘部分，移放在军L糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细茵茵向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入36C土1C恒温箱内培养18-24h , 10.5 挑取滤膜上符合下列特征的茵乎在进行车兰氏染色、镜检E37 Ii飞yf%+G/T 18204 , 10 - 2000 紫红色，具有金属光泽的菌落g深红色，不带或略带金属光泽的菌荡，淡红色，中心色较深的菌落.10, 6 将革兰民染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白陈培养液中，于36C士lC培养48h.产股产气者证实为大肠商群阳性.11 检验结果报告计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000mL 7)(样中的大肠菌群数。38
