1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 18630-2002 蔬菜中有机磷及氨基甲酸醋农药残留量的简易检验方法酶抑制法Method for simple determination of organophosphorus and carbamate pesticide residues in vegetables-Enzyme inhibition method 2002 - 01-28发布2002 - 06-01实施中华人国家质量监民共和国检验检疫总局发布213 GB/T 18630-2002 前言本标准在制定过程中主要参考了以下标准g食品中有机磷农药残留测定胆碱醋酶
2、抑制法(AOAC12,h 29. 049-29. 055) 本标准的附录A是规范性附录。本标准由辽宁省质量技术监督局提出。本标准由沈阳农业大学、沈阳市质量技术监督局苏家屯分局负责起草。本标准主要起草人=周艳明、高淑英、张会娟、王晓光、李亮亮、李海峰、吴小琳、牛森。214 GB/T 18630-2002 1 范围蔬菜中有机磷及氨基甲残留量的简易检验方法醋农药酶抑制法本标准规定了用酶抑制法测定蔬菜中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留的简易检验方法。本标准适用于蔬菜中有机磷农药及氨基甲酸醋农药残留的测定。2 原理有机磷农药及氨基甲酸醋类农药对胆碱酣酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农药种类
3、及其含量。在pH78的溶液中，腆化硫代乙酌胆碱被胆碱醋酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2，6二氯能盼褪色，褪色程度与胆碱黯酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性愈高时，吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸酶类农药存在时，酶活性受到抑制，吸光度值则较高。据此，可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酶类农药的残留情况。样品提取液用氧化剂氧化，可提高某些有机磷农药的抑制率，因而可提高其测定灵敏度，过量的氧化剂再用还原剂还原，以免干扰测定。3 试剂或材料3- 1 底物溶液，2%腆化硫代乙酷胆碱水溶液，1g矶化硫代乙酷胆碱，加缓冲液溶解并定容至50mLo 3.2
4、 缓冲液zpH7.71磷酸盐缓冲液gA液，1/15mol/L磷酸氢二销溶液z称取磷酸氢二纳(Na2HP， 12H2)2. 387 6 g加水定容至100 mL。B液1/15mol/L磷酸二氢饵溶液称取磷酸二氢铮0.9078 g加水定容至100mLo 取A液90mL、B液10mL混合，即得pH7.71磷酸盐缓冲液。3.3 显色剂，0.04%2，6-二氯能酷水溶液。3- 4 氧化剂，0.5%次氯酸钙水溶液。3.5 还原剂，10%亚硝酸锅水溶液。3- 6 胆碱醋酶液，0.2g酶粉(其制备方法见附录A)加10mL缓冲液溶解。3.7 脱色剂z活性炭。3.8 丙嗣=分析纯。3- 9 碳酸钙z分析纯。4 装
5、置4. 1 分光光度计。215 G/T 186302002 5 分析步骤以下操作可在150C30C温度下进行。5. 1 试样的制备蔬菜样品擦去表面泥水，取代表性食部，剪碎，取2g置于10mL烧杯中，加5mL丙酣浸泡5min , 不时振摇，加O.2 g碳酸钙(对于番茄等酸性较强的样品可加0.3-0.4g)。若颜色较深，可加0.2g活性炭，摇匀，过滤。5. 2 氧化取。.5mL丙酣滤液于5mL烧杯中，吹干丙嗣后，加0.3时，缓冲液溶解。加入氧化剂。.1mL.摇匀后放置10mino再加入还原剂。.3mL，摇匀。5. 3 酶解加入酶液0.2mL，摇匀，放置10mn，再加入底物溶液。.2mL，显色剂0.
6、1mL，放置5min后测定。5.4 测定分光光度计波长调至600nmt其他按常规操作，读取测定值。6 结果的表述6. 1 测定结果的使用当测定值在O.7以下时，为未检出。当测定值在0.7-0.9之间时，为可能检出，但残留量较低。当测定值为O.9以上时，为检出。测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。6.2 方法最低检出浓度本方法最低检出浓度见表10裴1最低栓出浓度农药西虹柿黄瓜商篱抗甥威O. 1 O. 2 O. 1 伏杀磷0.3 0.6 。.2敌敌畏1. 0 0.8 0.8 内吸磷O. 5 1.0 0.5 辛硫磷。.5 O. 4 O. 4 西维因1.0 1. 0 O. 5
7、甲拌磷1.0 1.0 O. 5 敌百虫0.3 0.8 0.3 乐果0.5 O. 5 0.4 甲基对硫磷Q.5 0.3 0.3 乙酿甲胶磷0.5 1. 0 O. 2 对硫磷21 1.0 5. 0 氧化乐果O. 1 O. 3 O. 1 映喃丹3. 0 3. 0 2. 0 甲胶磷10 15 12 二嗦磷1.0 3. 5 3.0 216 单位为毫克每千克生菜甘蓝O. 1 O. 3 0.5 0.5 1. 0 1. 3 1. 0 1.0 。.5 1.0 O. 5 0.5 0.2 O. 5 0.4 1. 0 0.4 1. 5 O. 1 。1。町1O. 5 4. 5 4.5 O. 1 O. 1 2. 0 3.
8、 0 15 15 2. 0 3.0 GB/T 18630- 2002 A.1 试剂A.1.1 0.1 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液附录A(规范性附录)胆碱醋酶粉的制备0.1 mol/L磷酸氢二锅溶液，l7.56g磷酸氢二锅(Na，HPO. 2H，O)溶于1000 mL水。0.1 mol/L磷酸二氢纳溶液:13. 80 g磷酸二氢销(NaH，PO. 2H，O)溶于1000 mL水。将12.3mL O. 1 mol/L磷酸氢二纳溶液与87.7mL O. 1 mol/L磷酸工氢锅溶液混合，即为O. 1 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液。A.1.2 Q. 005 mol/L pH6. 0磷磁缓
9、冲液取50mL O. 1 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液(A.1. 1)液加水稀释至1000mLo A. 1. 3 0.5 mol/L氢氟化纳-0.5mol/L氯化纳溶液1. 0 mol/L氢氧化锅溶液z取40g氮氧化纳溶于1000时，水中。1. 0 mol/L氯化销溶液g取58.5g氯化纳溶于1000 mL Jj(中。将上两液1: 1混合，即得0.5mol/L氢氧化纳-0.5mol/L氯化纳溶液。A.1.4 0.5 mol/L盐酸0.5mol/L氯化铺溶液1. 0 mol/L盐酸溶液g琅83.33mL浓盐酸溶于1000 mL水中。将1.0 mol/L盐酸溶液与1.0mol/L氯化纳溶液1
10、: 1混合，即得0.5mol/L盐酸。.5mol/L氯化纳溶液。A. 1. 5 梭甲基纤维素(CM纤维素)干粉A.2 装置A. 2. 1 梯度混合器=两瓶连通式，每瓶容量200mLo A. 2. 2 柱层析系统:1.5X40 cm玻璃层析柱，流量可达2mL/min蠕动泵。A. 2. 3 冷冻干燥机。A.3 程序A. 3- 1 竣甲基纤维素的处理取10g竣甲基纤维素(CM纤维素)干粉置于烧杯中，加人100mL O. 5 mol/L氢氧化销0.5mol/ L氯化纳溶液，混匀，静置15min后，用布民漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于100mL 1 mol/L盐酸溶液中，混匀，静置10min
11、后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100 mL 0.5 mol月，盐酸。.5mol/L氯化纳溶液中，混匀，静置15min后用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于O.005 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液(A.L 2)中。A. 3- 2 胆碱醋酶的提取取50g新鲜食用面粉置三角瓶中，加250mL蒸馆水，振荡30mno 静置30min以上，取上清液经5000 r/min离心20mino 收集上清液用冷冻干燥机浓缩至20mL左右，为胆碱醋酶粗提掖，保存于冰箱中待纯化。A. 3- 3 胆喊黯酶粗提掖的纯化将处理好的竣甲基纤维素悬浮液加人层析柱中，加150mL O. 005 mol/L pH6.。磷酸缓冲液217 GB/T 18630 2002 (A. 1. 2)于梯度混合器的初始液瓶中，加150mL O. 1 moI/L pH6. 0磷酸缓冲液(A.1. 1)于梯度混合器的高浓度液瓶中。连接柱层析装置，以2mL/min流速做梯度洗脱，收集后1/2流出液。A. J 4 冷冻干燥将A.3. 3中的流出液用冷冻干燥机干燥成干粉，以0.2g/瓶封装于安瓶瓶中备用。置4C冰箱中可保存l年有效。218
