1、G/T 18636 2002 前L B一半标准根据我国近:.j-rx、I蓝占病诊断的研究成果和技术的发版.参号l世界动物J!ll组织iWorlcl()rg川Ization0人nimalHealth(英),Officf lntentional 世sEpi元。otic(法).()IEJ际准i文件t世界动物jlll 组织推样的诊断)J挝、手11吐物制品标准于册2. 9条.监吕柄和澳大于HV动物疫祸标汗i诊断h挝、Itl1IHmklIV 市市编写的。牛二标准引用r(;L/T 1 08!) -20(lI)(i微蜀中和IJ除此病毒分离和l鉴定方法六千1关规在JiiL1(，舌的是由库蝶传播、蓝吕病病毒引起的
2、仪;可反匀动物的严重传染病。蓝舌IJ病毒系呼肠孤州市科环状病Iff属B群成员。国际己知盲21个lliL，肯型，在监l-F尹与环状病自属相关核;有交1.反应:孩病毒土安11起绵斗旦发f丙和死1_-:.牛反其他反结功物常为隐刊感染，但f通过媒介昆虫传播本的。鉴于i衷病的诊断和l检疫技术复杂，闵此Jv.迷、7该病的综合诊断技术标准.这是制定丰标准的宗旨。丰标准烛!泛的方It、.分另IJ适用于病毒分离将定、病!京检测、病毒血清刑鉴定和抗体检测等小同需要。本标准的附录且、附录B都是标准的附录.附录C是提示的附录。卒归准IIIJ户人民兵和国农业部提出3牛二标准111食同动物价疫标准化技术委员会归10 斗、
3、标准起草单位云南11热带、w热带动物病-t!病重点实验豆、农业部动物检疫所、大rJ!动植物检疫4又标准主要赳草人张念根、杨承i由、李志华、张富强、胡玉玲、张Jt礼、马u飞超、赵样平、向文彬。1 I :, 中华人民共和国国家标准蓝舌病诊断技术G/T 18636 2002 Diagnostic techniques for bluetonguc 1 范围本标准H航吕州的诊断技术和程序c斗飞机Ift适用于歧舌病的诊断和检疫。4、5、6章用于病毒分离鉴定和病原检测.7、8章用于病毒的血清型鉴定，J，IO章JiJt抗体检测。2 引用标准f列标准所包拍的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准
4、出版时，所示版本均为11放所千I标准都会被修订使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。(;11fT 1 ROR9 20()O 蓝占病敝犀l且清巾归i式份提病毒分离和鉴远方法3 病毒分离和鉴定3. 1 器械和l设备3.1.196Lm织培养板(平底，简称96L板儿单道微量IJIl样器(0.5 /， 10 / 5L 10L . . 1() /d，2J() /,L. 2()() /L 1 ()()() /，)及滴虫.八道连续加样器(50/，100L.1501.，2001.)及滴头。3. 1. 2 .川、20 (、日U(冰轩，普通恒温培养箱及二氧化碳培养箱。3. 1. 3 .电阳、片L器.R
5、Ri量箱或1(n;r，用灯，组织揭碎器及擦镜纸(高压灭菌备用)0 3. 1. 4 超卢波粉碎器，低述离心机，倒官显微镜及荧光眼微镜。3. 2 i; iflJ勺材料3. 2. 1 月f东扰凝血采血节气3. 2. 2 细胞蚊f细胞(日/:16)、仓鼠肾细胞(lHK川或非洲绿猴肾细胞(Vero)。3. 2. 3 细胞峰养液反分散液(按常规配方自己制)。3.2.4111世无污染，3个月内在4C保存，常温保存15d肉，臼I用于检测。8. 2 试验方法8. 2. 1 琼脂平皿的制作8.2.1.1 琼脂糖慕配制琼脂糖咔理盐水(I.8g0.9g 100 mL 按1 10 000比例加入叠氮销或硫柳录，调整pH
6、7.47.6，高压消毒10min Q 8.2.1.2 琼脂平皿和j备:融化的琼ii待冷至45C50(、时，以元菌手术jiiJ人直径6cm平皿中，每平皿约7mL巳厚度约为4mm，待凝固后置4C保存备用。8.2.1.3 tJ孔:用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平皿上fI孔(各孔排例如图l所示)。孔距为3mm，打孔后用针挑出切下的孔内琼脂块，封底。( 储存液1. 59日2.93 g 0.10 g 1 000 mL 4 C保存备用8.2 g 1 000 mL 2.10 g 100 mL 称取33，5，-5四甲基联苯胶30mg于100mL甲醇中，室温搅拌数小时至完全溶解，用棕色瓶避光保存。B4
7、 PBST-SM PBST 脱脂奶粉85 2 mol/L硫酸100 mL 1 g 125 86 双蒸饱水浓硫酸。.1 %茶黑蓝染色液配制荼黑(naphthalcncblack) 乙酸乙酸饷(无水)加蒸惰水至G8/T 18636- 2002 1 GlI mL 20 mL . 0 g 60. () mL 13. 6 g 1 () mL 附录E(提示的附录)Karber方法Karber法的公式见式(C1 )用常用对数Og)计算.IgTCI D, (或J，D气。、EIIJ，) L十d(5-). 5) 式中:L病毒的最低稀释倍数;d 稀释系数，即组距;5 细胞病变比值的和(不包最低稀释度细胞病变的比值)
8、。以下例(见表(1)说明表Cl病毒TCID，商定病毒稀静度1 () , 10 3 10也病毒稀辑度2 _- 3 4 l g) 细胞病变比值4/4 4/4 4/4 本例1二2，d=-1，s二1/4+4/4十3/4+2/4十O/44.2代人公式，lgTCID;o-2+(-1)X(4. 25-0. 5) -5.75 7IYD50二10:i.7 S 奇反对数表可得TCln1/560000 10 . _ 5 3/4 10- 6 2/1 如丰干稀料度均为O.1 mL，那么1mL中含5600 000个TCID川或1Ofi. 75个TCID， ( Cl ) 10 -, 7 。.11 病毒毒价通常以每毫升含多少TCID(或u，ELDi1l)表示，卒例病毒毒价为每毫Jj含5600 000 个I门D.126
