1、GB/T 18637-2002 前言牛病毒性腹泻/粘膜病Cbovineviral diarrhea/mucosal disease ，BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒CBVDV)引起的牛的种以粘膜发炎、康烂.坏死和腹泻为特征的疾病。应用微量血清中和试验检查BVD/MD抗体，具有其特殊意义，它不仅可以定性，而且还可以定量，并从抗体量的动态变化中，可以判定病牛是以前感染过本病，还是现在正在感染过程中，从而为防治本病提供科学依据。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准出中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国兽药监察所、农业部动物检疫所
2、。本标准主要起草人dl振华、郑志刚。127 中华人民共和国国家标准牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术Diagnostic techniques for bovine viral diarrhea/mucosal disease 1 范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病也VD/MDl的诊断技术要求。本标准适用于BVD/MD的流行病学调查和检疫。2 定义本标准采用下列定义。细胞玻片GB/T 18637-2002 放置在莱顿氏(Leightons)管或其他用作培养细胞的小瓶中，长有单层细胞的盖玻片。3 BVD/MD病毒分离与鉴定3- 1 材料准备3- 1. 1 阳性参照毒株为牛粘膜病病毒俄勒冈毒株(Ore
3、gonC V)。3- 1. 2 日VD/MD荧光抗体(BVD/MD-FA)、阳性血清。3. 1. 3 荧光显微镜:采用蓝紫光为激发光的透射式或落射式荧光显微镜。3. 1. 4 牛妻牛(或胎牛)血清无BVD/MD抗体和无污染。3- 1. 5 细胞培养瓶扁瓶、Leighton气管、o.17 mm厚度的盖玻片(1.0 cm X 3. 8 cm或0.8cm X 2. 4 cm) O. 8 mm -1 . 0 mm厚的普通玻璃载片，带盖湿盒。3- 1. 6 溶液配制，pH7.07. 2 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液.pH9.09. 5 0.5 mol/L碳酸缓冲甘汹IA，附录A(标准的附录门。3-
4、1. 7 细胞培养液.见附录B(标准的附录)。3- 1.8 1京代细胞培养物2见附录C(标准的附录), 3- 2 病毒分离3. 2. 1 样品的采集3- 2.1.1 对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。3- 2.1.2 对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采血或鼻分泌物。3.2.1.3 对流产、死胎.采胎儿的组织。3.2. 1.4 对怀疑为死于粘膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。直11果肠道样品已发生自溶，可采扁桃体或淋巴结。3- 2. 2 样品处理3- 2. 2. 1 血液用常规方法分离而1清。3.2.2.2 凝血块z冻融数次后，取析出的七清液(加入适量的双抗即青链霉
5、素)。3. 2.2. 3 组织样品用含10001U/时，双抗的细胞培养液作1, 10倍的乳剂，离心取上清液。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局却02-02-19批准2002.05.01实施12H GB/T 18637一20023-2.2.4 精液冻融3次(或超声波裂解处理)，用细胞培养液作1 10倍稀释，离心取上清液。3- 2.2.5 鼻分泌物用含1000 IU(mg)/mL双抗们的培养液4倍稀释后，离心取上清液。以上各样品处理后均需作元菌检验。3- 2. 3 样品的接种培养3.2.3.1 将10mL牛辜丸原代细胞(见附录。接种于小扁瓶，置37C静止培养。培养到细胞形成80%以上单层。3.
6、2. 3. 2 取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.1-3.2.2.5的样品，每瓶接种样品1mL , 每份样品接种3瓶。3.2. 3. 3 置37C吸附2h-3h。3. 2. 3. 4 吸附后，将样品倒去，加维持液见附录B中Bl，另加3%棋牛血清(3.1.4)J10 mL置37C恒温培养。3. 2.3.5 培养6d 后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物c3. 3 样511分离物的病毒鉴定3. 3. 1 分离物的细胞玻片培养3.3.1.1 将1mL牛辜丸原代细胞悬液，接种子带盖玻片(3.1.们的Leightons管，置37C培养，至盖玻片r细
7、胞生长成80%的单层。3.3.1.2 取3.3.1.1中4个Leightons管，倒去培养液，每瓶接种3.2.3.5中样品分离细胞培养物1 rnLo 3. 3.1.3 置37C吸附2h-3 ho 3.3. 1.4 吸附后，力11维持液1mL.置37C恒温培养3d 0 3. 3.1.5 取出细胞玻片用磷酸盐缓冲液(见附录A中A1)轻轻漂洗，倾去液体，自然干燥。用纯丙嗣室温固定10min-15 min。3. 3. 1. 6 取各组固定后的细胞玻片(样品组取半数，余者在必要时作抑制染色试验用)，置1显盒内，细胞面向上，滴加BVD/MDFA(3. 1. 2)，并使免疫荧光抗体(FA)铺满而又不溢出于细
8、胞面。将M盒盖盖严，置37(、染色2h。随后取出，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，倾去液体。3.3. 1.7 封片将细胞回向下，用碳酸盐缓冲甘汹(见附录A中A2)封贴于载玻片上。3. 3. 2 x、I照3.3.2.1 阳性参照组z取3.3.1.1中带有细胞玻片的Leighton5管2管，每管接种O.1 mL 100 1CID 的OregonCV (3. 1. 1)，此后按3.3.1.3-3. 3. 1. 7方法操作。3.3. 2.2 阴性对照组取3.3.1.1中带细胞玻片的Leightons管2管，按3.3.1.5-3. 3. 1. 7方法操作。3. 3. 3镜检3.3. 3. 1 被BVD/MDV感
9、染的细胞，在蓝紫光激发的荧光显微镜下，胞浆呈黄绿色的荧光，并常见有闪烁明亮黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。未感染细胞无荧光。3. 3. 3. 2 荧光观察记录:荧光在激发光照射下，随时间延长而明显减塌，因此在染色后，应尽快镜检及时记录，记录可分为2川()无荧光gb) (十)荧光微弱，形态不清晰;c) (十十)荧光较亮，形态清晰gd) (+斗斗十十十十)荧光较强，明亮闪烁，形态清晰。3. 3. 4 荧光抑制试验1 )双抗指青霉草IU)和链霉素(Ilg)。129 GB/T 18637- 2002 3. 3.4. 1 取3.3.1.6中固定后余下的细胞玻片，滴加IBVD/MDV的阳性血清门.1.2
10、)，置37C作用1 h后，用磷酸盐缓冲液充分洗涤3次。3.3.4.2 此后按3.3.1. 63. 3. 1. 7中规定进行操作。3. 3. 4.3 判定:在仰制试验中，荧光被BVD/MD的阳性血清所抑制，则判定原样品分离物的荧光为BVD/MD病毒抗原特异荧光。3. 3. 5 终判定当阴性对照为(-)，阳性参照为(+十)以上，抑制试验对照片荧光被抑制，被检组为3.3.3.2中c)和d)时判为分离病毒阳性;为3.3.3.2中b)者应重检，重检后仍为3.3.3.2中b)者，则如l阳性;被检m为3.:l.3.2中a)者，判阴性。当阳性参照不出现特异荧光，为元结果，应予重检。4 微量血清中和试验4. 1
11、 材料准备4. 1. 1 标准毒株OregonC V 0 4. 1. 2 标准阳性血清、标准阴性血清。4. 1. 3 细胞可用核牛原代肾细胞、辜丸细胞和鼻甲细胞(见附录C)或牛鼻甲细胞系(MDBK)细胞。4.1.4 培养基4. 1.4. 1 稀释液营养液，pH7.07. 2，每毫列加100mg链霉素和100JU青霉素，按说明书配制。4. 1.4. 2 t长液:营养液加10%楼牛血清(3.1.4)。4. 1.4. 3 维拌液，营养液加Z%5%楼牛血清。4. 1. 5 被枪血清无菌静脉采血.常规分离血清，56C火活30ml口。4. 1. 6 微量细胞培养板(简称微量板)96孔平底板。4. 1. 7
12、 加样器，单通道或多通道的可调加样器。4.2 操作程序4. 2. 1 定量测定4.2.1.1 用多通道加样器于96于L微量板中每孔加稀释液(4.1.4. 1 )50L 4.2. 1. 2 用单通道加样器取501.灭活的被检血清加于微量板的第一排孔中，每份样品加4个孔。4. 2. 1.3 用多通道力11样器(调至50L)从第一排孔开始作连续倍比稀释，直至最后一个孔.并从最后孔中弃去50L稀释物。4.2.1.4 用稀释液将标准毒株OregonC V (4. 1. 1)稀释成含100TCIDc，o/50L的工作液。4.2.1.5 用多涵道加样器从第二排孔开始每孔加病毒工作液50L，第一排孔中加50f
13、L稀释液作为被检血清毒性对照。4.2.1.6 将微量板盖严，置于37C 5%二氧化碳培养箱中中和2h3 ho 4.2.1.7 将细胞悬液(见附录C)100I，L加到微量板各孔中，或将生长成良好单层的细胞用EDTA腕酶消化液消化分散后，用生长液(4.1.4. 2)配制成含40万/mL的细胞悬液加到微量板的各孔中，每孔1001.0 4. 2. 1.8 按4.2.1.6中方法踏养6d，从第四天开始观察结果，并于第6d作终判。4.2.1.9 时验需作下列对照.a)阳性血清(4.1.2)对照:2倍稀释血清50L十50I，L病毒工作液+100L细胞悬液。b)阴性血清(4.1.2)对照32倍稀释血清50L十
14、50L病毒作液十100L细胞悬液。c)正常细胞对照:细胞悬液100L+维持液100L。d)病毒用:最滴定:将病毒E作液用稀释液作气次10倍递进稀释取)病毒I作液100TCID，!SOL，50川，十稀释液50L+细胞悬液100L;2) 10 病毒工作液10TCID，/50L，50L十稀释液50111-十细胞悬液100fL; 3) !O 2病毒工作液1Tl丁IDc，/501.，50，1.十稀释液501.十细胞悬液100L;J3() GB/T 18637 2002 1 1 10斗内毒1作液。TC1D，/50I, L , 50L斗稀释液50L十细胞悬液100ILL 。以1各对照均作t个乱。4, 2.2
15、 定性试验4.2.2.1 用多通迫JJU样器于创孔微量板中每孔加稀释液10L，4.2.2.2 用币通道加样器取10Id. j己活的被枪的li青加到微量版与血清编号相应的孔中.每份血清作4个孔。4.2.2.3 病毒工11液稀释方法同4.2.104. 2.2.4 用多通道加样器将病毒工作液加到微量板的各孔中，每孔50L。4.2.2.5 以F操作按4.2. 64. 2. . 9规定进行。4.2.3 双份血清测定4.2.3.1 双份被枪血清取自同年动物，间隔21d，按4.1. 5采集、处理。4.2.3.2 试验操作方法lii1.2.1，4.3 结果判定试;H司第，ld开始观察结果.并于第6d作终判。:
16、5细胞对照孔内细胞单医生长良好，病毒用最在50TClfJ，!50L 500 TCID.，/50L范围之内.阳性血清对照孔小fti现细胞病变，阴性血清对!阳、孔出现细胞病变，证明试验成立.可以进行结果判定，否则.试始不成立，应重件。4. 3. 1 判定标准4. 3. 1.1 )豆最试验每份l1清lci-稀将度的4个孔中有两个于L完全被保护，不出现细胞病变(CPEl时，该稀释皮jllJ数即为该国1清的抗体滴度。4. 3. 1.2 定性试验:被检血清在1, 5稀释时有2个或2个以上孔的细胞被完全保护，该血清即为阳性。4.3.1.3 双份血清测定:当相隔21d的第三份血清的滴度高于第一份血清两个或两个
17、以上滴度，如j证明该动物Lf在发病过程中。131 G/T 18637-2002 附策A(标准的附录滚滚的建制A 1 pH7. O7. 6 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(P13Sl的配制A 1. O. 2 mol厅，磷酸缓冲液(PBl(母液的需lliJ.!乱表A1，表/1各种pHO.2mol/LPB(悖液)的配制比例亵(100mL母液)0.2 mol!L磷酸笨二锅(Na，HP()，)0.2 mol凡，磷酸二氧量每(NaH，PO，)pH mL mL 一寸叫嘈，、冉冉.一一一7, 0 61. 0 39.。L 舍-_【咱A一-7. Z 72.0 28.0 一一7, 4 81牛。19, 0 由7、8
18、87.。13.0 按所需pH值蜜表A1.按体积比例混合二液，即为。.2mol/L母液。Al.2 自.01mol/L磷酸盐缓冲液幸亏夜幸!:搏母液用蒸镶水作2倍稼辈辈，并按0.85%加入氯化锅里F得。A2 pH9, O，9. 5 0.5 mol/L碳酸盐缓冲甘泊的配制A2. 119. O9. 5 0.5 mol/L碳酸盐缓冲液的配和j见表A20表A2pH9. O苦.50.5 mol!L碳酸盐缓冲液().5 mol/L碳酸氢铀(NaHCO.，) 0.5 ffiol/L lilI醺锵川剧CO，)pH mL mL 唱白骨_，】9. O_C 9. S 3 l 按表A2所列体积混合工液即可。A2. 2 p
19、H9. O 9. 5碳酸苦泊的自己帘.):碳酸盐缓冲液z甘泌中性)=1:吉，混合郎得。81 汉克氏(Hanks)尿液(lOf音原液氯化销(NaCll晴草酸氢:1饷(Na2HPO， 12日，0)靠在化挥(KCI)磷酸二氧仰(KH2PO.)硫酸续(MgSO， 7日，0)筒萄糖氯化钙飞CaCI，) 双蒸馆水Jm至附雪景B(标准的附录)编臆培养渡的辈革备40.0 g O. 6日2.0 g 0.3 g l. Og 5.0 g 0.7 g 5OmL 500 mL bo 1 mL三氯甲烧充分振荡，4C冰箱保存。Hanks液为Hanks尿液稀料10倍。132 rnL GB/T 18637 -2002 Hank
20、s液)000 mL十4mL盼红.68.94 kPa灭菌10min 0 B2 0.5%乳汉液L-H液)Hanks 水解乳蛋白盼红69 kPa灭菌10min.4C冰箱保存。) 000 mL 5g 4 rnL 附录C(标准的附录)牛事丸(或牛肾、鼻甲)原代细胞的制作C1 选择健康初生棋牛，放血致死，无菌取宰丸或肾脏、鼻甲组织。C2 将组织(牛肾剪取皮质部).剪成1mm3,_, 2 mm3小块组织.用含:100IU /mL双抗的汉克氏液(见附录B中Bl)漂洗23次，并漂去漂浮的碎渣组织，倒去液体。C3 按组织重量的5倍，加入0.25%膜酶-Hanks液(pH7. 4 7. 8) .置37C水浴中消化30min-40 mino沉淀片刻，除去膜酶。C4 用汉克氏液洗23次后，加入适量营养液【含5%10%核牛血清的乳汉液(见附录B中B2)J吹打、分散己消化疏松的组织。用4层纱布滤过，制成约40万/时_70万/rnL活细胞悬液备用。C5 也可分装于培养瓶，培养成单层，保存于4C备用。J .13
